酿酒酵母内三对负相关基因的实验研究

发布时间：2017-05-18 02:07

  本文关键词：酿酒酵母内三对负相关基因的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在基因表达谱中,相关基因的表达常常会出现同时上调和下调的情况,且上调与下调的基因的数目相差不多,从数学角度对上调基因和下调基因的这种对应关系进行了定性阐述,认为它们是负相关的。据此,提出“负相关模式”这一概念,它是指如果基因集V中的两个子集V1和V2在时间段T中具有相反的表达趋势,而且每个子集之内的基因都具有相似的表达趋势,那么就可以说子集V1和子集V2是一个负相关模式。本课题组就此模式设计出NCFCA算法,并将其应用于酿酒酵母细胞周期的基因表达谱和应激响应的表达数据集的研究中,结果发现微小染色体维持蛋白基因与核心组蛋白基因,核糖体蛋白基因与热休克蛋白基因,淀粉及蔗糖通路与嘌呤通路基因,这三对基因组可能符合负相关模式概念。本研究是基于上述关于基因“负相关模式”的理论计算结果的实验验证。采用了荧光实时定量PCR技术,以稳定表达的管家基因为内参基因,分析三对负相关基因的动态表达情况,以探索它们之间的关系,以期为基因的负相关表达模式提供实验支持。本研究中首先采用十三肽配型激素α因子、羟基尿、密度梯度离心法、饥饿诱导法同步细胞周期,检测最优同步方法。设计筛选内参基因和6组基因的引物,优化退火温度,通过检测扩增效率和相关系数值进一步验证引物。经ge Norm软件分析内参基因的稳定性,筛选稳定表达的内参基因,用于目的基因的表达量矫正。根据三对负相关基因的不同表达信息,分别给予酿酒酵母不同的生长环境,定时提取总RNA,反转录合成c DNA,再采用荧光实时定量PCR技术检测基因表达情况。然后对三对基因进行GO功能富集分析,最后分析三对负相关模式基因形成的原因。结果表明:α因子同步化处理效果最好;ge Norm软件分析结果表明内参基因ACT1和ALG9在本实验条件下表达最稳定,能校正目的基因的表达量;酵母中MCM2-7六个基因与核心组蛋白HHT1,HHT2,HHF1,HHF2,HTA2,HTA1,HTB2,HTB1八个基因共同参与了DNA构象的变化、蛋白质-DNA复合物的组装、细胞大分子复合物的组装、细胞成分的组装和合成等生物过程,它们随着细胞周期的进行而同时被上调或下调,并且呈现出相反的趋势。另外一对是热休克蛋白基因(HSP104,HSP12,HSP26,HSP31,HSP42,HSP60,HSP78,HSP82)与核糖体蛋白基因(RPS5,RPS18A,RPS18B,RPS28A,RPS28B,RPL5,RPL18A,RPL18B,RPL35A,RPL35B),它们各自组内均具有显著的功能相似性,但是它们每两组基因之间没有功能上的相似性,两组基因会随着温度的变化(升温和降温)进行上调和下调,并且呈现出相反的趋势。第三对是淀粉及蔗糖通路基因(GSY2,NTH1,GLC3,PGM2,TPS1,TPS2)与嘌呤通路基因(RNR1,ADE1,IMD3,IMD4,PRS2,PRS1,ADE13,PRS4,PRS3,PRS5,APT1,ADE6,ADE8,ADE2,ADE17,ADE4,AAH1),它们各自均具有显著的功能相似性。但是在氧化应激过程中表现出相反的表达模式,淀粉和蔗糖代谢通路基因的表达在氧化应激中几乎都是被激活的,而嘌呤代谢通路基因的表达在氧化应激中都是被抑制的。此外,对于三对基因形成负相关模式的原因也作出了探讨,它们分别是由Clb-Cdk1与TORC1的调控。综上所述,实验结果证明三对基因确实呈负相关模式,与本课题组理论计算结果相符,并发现其形成原因分别为Clb-Cdk1和TORC1在酵母细胞内的调控作用,但具体的机制尚待进一步研究。
【关键词】：酿酒酵母 负相关模式 细胞周期 应激响应 荧光实时定量PCR
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 1 绪论11-25
• 1.1 问题的提出及研究意义11-12
• 1.1.1 问题的提出11-12
• 1.1.2 研究意义12
• 1.2 国内外研究现状12-20
• 1.2.1 负相关模式12-14
• 1.2.2 微小染色体维持蛋白（MCM）14-17
• 1.2.3 核心组蛋白（Core Histone）17-18
• 1.2.4 热休克蛋白18-19
• 1.2.5 核糖体蛋白19-20
• 1.2.6 淀粉及蔗糖代谢通路20
• 1.3 本文研究的目的和研究内容20-23
• 1.3.1 本文研究的目的20-21
• 1.3.2 本文研究的内容21-23
• 1.4 本文的创新点23-25
• 2 酵母细胞周期同步化处理25-31
• 2.1 引言25
• 2.2 材料与仪器25-26
• 2.2.1 实验材料25
• 2.2.2 主要仪器设备25-26
• 2.2.3 主要试剂26
• 2.3 实验方法和步骤26-27
• 2.3.1 不连续密度梯度离心法26
• 2.3.2 营养饥饿法26-27
• 2.3.3 α 因子处理27
• 2.3.4 羟基尿处理27
• 2.4 结果与分析27-29
• 2.5 本章小结29-31
• 3 酵母细胞周期内MCM与核心组蛋白基因的表达分析31-59
• 3.1 引言31
• 3.2 材料与仪器31-32
• 3.2.1 实验材料31
• 3.2.2 主要仪器设备31-32
• 3.2.3 主要试剂32
• 3.3 实验方法和步骤32-37
• 3.3.1 引物的设计32-34
• 3.3.2 内参基因PCR扩增条件的优化34-35
• 3.3.3 酿酒酵母总RNA的提取35-36
• 3.3.4 c DNA第一链的合成36
• 3.3.5 q PCR反应36
• 3.3.6 数据分析36
• 3.3.7 两组基因功能富集分析36-37
• 3.4 结果与分析37-53
• 3.4.1 引物的设计37
• 3.4.2 内参基因的稳定性分析37-38
• 3.4.3 荧光定量q PCR退火温度的优化38-39
• 3.4.4 总RNA质量检测39
• 3.4.5 MCM及核心组蛋白基因的表达情况39-40
• 3.4.6 两组基因功能富集分析40-53
• 3.5 讨论53-56
• 3.5.1 内参基因的选择53-54
• 3.5.2 微小染色体维持蛋白及核心组蛋白q PCR54
• 3.5.3 微小染色体维持蛋白及核心组蛋白功能富集分析54
• 3.5.4 微小染色体维持蛋白及核心组蛋白形成负相关模式的原因54-56
• 3.6 本章小结56-59
• 4 酵母细胞内核糖体蛋白与热休克蛋白基因的表达分析59-73
• 4.1 引言59
• 4.2 材料和仪器59-60
• 4.2.1 实验材料59
• 4.2.2 主要仪器设备59-60
• 4.2.3 主要试剂60
• 4.3 实验方法和步骤60-63
• 4.3.1 引物的设计与合成60-62
• 4.3.2 酿酒酵母总RNA的提取62
• 4.3.3c DNA第一链的合成62
• 4.3.4q PCR反应62
• 4.3.5 两组基因功能富集分析62-63
• 4.4 结果与分析63-68
• 4.4.1 总RNA质量检测63
• 4.4.2 核糖体蛋白与热休克蛋白基因的表达情况63-64
• 4.4.3 核糖体蛋白与热休克蛋白功能富集分析64-68
• 4.5 讨论68-71
• 4.5.1 核糖体蛋白与热休克蛋白基因q PCR68
• 4.5.2 核糖体蛋白与热休克蛋白基因功能富集分析68-69
• 4.5.3 核糖体蛋白与热休克蛋白基因负相关的形成原因分析69-71
• 4.6 本章小结71-73
• 5 酵母细胞内淀粉及蔗糖通路与嘌呤通路基因的表达分析73-85
• 5.1 引言73
• 5.2 材料和仪器73-74
• 5.2.1 实验材料73
• 5.2.2 主要仪器设备73-74
• 5.2.3 主要试剂74
• 5.3 实验方法和步骤74-77
• 5.3.1 引物的设计与合成74-76
• 5.3.2 酿酒酵母总RNA的提取76
• 5.3.3c DNA第一链的合成76
• 5.3.4q PCR反应76
• 5.3.5 两组基因功能富集分析76-77
• 5.4 结果与分析77-81
• 5.4.1 总RNA质量检测77
• 5.4.2 淀粉和蔗糖代谢通路基因和嘌呤代谢通路基因的表达情况77-78
• 5.4.3 淀粉和蔗糖代谢通路基因及嘌呤代谢通路基因功能富集分析78-81
• 5.5 讨论81-84
• 5.5.1 淀粉和蔗糖代谢通路基因及嘌呤代谢通路基因q PCR81-82
• 5.5.2 淀粉和蔗糖代谢通路基因及嘌呤代谢通路基因功能富集分析82
• 5.5.3 淀粉和蔗糖代谢通路基因及嘌呤代谢通路基因负相关的形成原因分析82-84
• 5.6 本章小结84-85
• 6 结论和展望85-89
• 6.1 酿酒酵母细胞周期同步化85
• 6.2 内参基因的选择及引物设计85
• 6.3 三对“负相关基因”的表达情况85-86
• 6.4 三对负相关基因的功能富集分析情况86
• 6.5 MCM与Histone基因负相关模式形成原因86
• 6.6 核糖体蛋白与热休克蛋白基因负相关模式形成原因86-87
• 6.7 淀粉和蔗糖通路与嘌呤代谢通路基因负相关模式形成原因87
• 6.8 后续工作的展望87-89
• 致谢89-91
• 参考文献91-99
• 附录99
• A作者在攻读学位期间发表的论文目录99

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本文编号：374920