白菜TCP基因家族的鉴定及利用CRISPR-Cas9系统进行编辑的初步探索
发布时间：2023-02-26 02:08
菜心(Brassica rapa L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)属于十字花科芸薹属芸薹种,是中国南方的特产蔬菜,在每日蔬菜供应中占有重要地位。菜心的叶作为主要的食用部位,叶型的好坏直接决定着菜心的品质和价值。在植物的叶和花发育等重要生命活动的进程中,TCP转录因子家族发挥着重要的作用,研究TCP基因家族的功能将为选育优良叶型的白菜新品种奠定基础。传统的育种方法存在着许多局限性,而CRISPR-Cas9定向基因编辑系统能对特定的DNA片段实现编辑、插入和敲除,是目前最高效和便捷的基因编辑技术。CRISPR-Cas9系统在白菜类作物中的应用报道较少。本研究通过生物信息学分析鉴定了白菜中的TCP转录因子基因家族,并进行白菜愈伤组织再生体系的优化和菜心CRISPR-Cas9遗传转化体系的初步探索,为白菜CRISPR-Cas9基因编辑系统的建立奠定基础。得到如下实验结果:1、白菜TCP转录因子基因家族的鉴定。通过BRAD网站获取白菜TCP基因家族所有39个成员的CDS序列。通过BRAD和Phytozome分别整理白菜和拟南芥基因组中TCP家族的氨基...
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 TCP转录因子家族的研究进展
1.1.1 TCP转录因子家族的发现
1.1.2 TCP转录因子的特点
1.1.3 TCP转录因子参与植物发育
1.1.4 TCP转录因子的其他功能
1.2 CRISRP-Cas9系统的研究进展
1.2.1 CRISPR-CAS9的发现与应用
1.2.2 CRISRP-Cas9系统的结构与原理
1.2.3 CRISPR/Cas9系统基因编辑后的鉴定
1.2.4 CRISPR/Cas9系统的优势
1.3 本课题的目的和意义
2 白菜TCP基因家族的鉴定
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 半定量PCR引物
2.1.3 实验仪器和试剂
2.2 方法
2.2.1 TCP转录因子家族基因的鉴定和同源进化树构建
2.2.2 利用Circos软件定位基因
2.2.3 菜心总RNA的提取和质量检测
2.2.4 cDNA第一条链的合成
2.2.5 半定量PCR检测菜心TCP转录因子的表达
2.3 结果与分析
2.3.1 白菜TCP转录因子基因家族的鉴定
2.3.2 白菜TCP转录因子基因家族进化树的构建与分析
2.3.3 TCP基因家族的染色体定位与共线性关系
2.3.4 白菜TCP基因家族在叶片发育和形态建成中的转录水平
2.4 小结与讨论
3 菜心不定芽再生体系及遗传转化体系的优化
3.1 材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂及配制
3.1.4 培养基组成及配制
3.1.5 菜心高频不定芽再生体系所用的优化培养基
3.1.6 根癌农杆菌介导的菜心遗传转化体系的优化培养基
3.2 方法
3.2.1 菜心遗传转化系统的初步探索
3.2.1.1 种子的消毒处理
3.2.1.2 外植体的获取和培养
3.2.1.3 不同浓度gelzan含量对于不定芽诱导的影响
3.2.1.4 不同浓度AgNO3对菜心不定芽诱导的影响
3.2.1.5 不同激素组合对菜心不定芽诱导的影响
3.2.3 菜心遗传转化系统的初步探索
3.3 结果与分析
3.3.1 菜心不定芽再生体系的建立
3.3.1.1 Gelzan植物凝胶对不定芽诱导的影响
3.3.1.2 AgNO3对菜心不定芽诱导的影响
3.3.1.3 激素浓度对不定芽诱导的影响
3.3.2 菜心遗传转化体系的建立
3.4 小结
3.4.1 菜心不定芽再生体系的建立
3.4.2 菜心遗传转化系统的初步探索
4 菜心CRISPR-Cas9系统的初步探索
4.1 材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 质粒和菌株
4.1.3 TCP14基因的sgRNA1和sgRNA2和pAtU6引物的合成
4.1.4 实验仪器
4.1.5 实验试剂及配制
4.1.6 大肠杆菌和农杆菌培养所用的培养基
4.2 方法
4.2.1 设计sgRNA靶标序列
4.2.2 sgRNA Oligo二聚体的制备
4.2.3 质粒酶切与产物连接
4.2.4 质粒转化DH5a大肠杆菌感受态
4.2.5 提取重组质粒
4.2.6 重组质粒转化农杆菌(冻融法)
4.2.7 菌液PCR鉴定阳性转化子
4.3 结果与分析
4.3.1 CRISPR-Cas9载体的构建
4.4 小结
5 总结与讨论
参考文献
附录
附录A 主要试剂
附录B 仪器
附录C 白菜TCP转录因子的信息和分类情况
附录D 本研究所用的引物
致谢
本文编号：3749594
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 TCP转录因子家族的研究进展
1.1.1 TCP转录因子家族的发现
1.1.2 TCP转录因子的特点
1.1.3 TCP转录因子参与植物发育
1.1.4 TCP转录因子的其他功能
1.2 CRISRP-Cas9系统的研究进展
1.2.1 CRISPR-CAS9的发现与应用
1.2.2 CRISRP-Cas9系统的结构与原理
1.2.3 CRISPR/Cas9系统基因编辑后的鉴定
1.2.4 CRISPR/Cas9系统的优势
1.3 本课题的目的和意义
2 白菜TCP基因家族的鉴定
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 半定量PCR引物
2.1.3 实验仪器和试剂
2.2 方法
2.2.1 TCP转录因子家族基因的鉴定和同源进化树构建
2.2.2 利用Circos软件定位基因
2.2.3 菜心总RNA的提取和质量检测
2.2.4 cDNA第一条链的合成
2.2.5 半定量PCR检测菜心TCP转录因子的表达
2.3 结果与分析
2.3.1 白菜TCP转录因子基因家族的鉴定
2.3.2 白菜TCP转录因子基因家族进化树的构建与分析
2.3.3 TCP基因家族的染色体定位与共线性关系
2.3.4 白菜TCP基因家族在叶片发育和形态建成中的转录水平
2.4 小结与讨论
3 菜心不定芽再生体系及遗传转化体系的优化
3.1 材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂及配制
3.1.4 培养基组成及配制
3.1.5 菜心高频不定芽再生体系所用的优化培养基
3.1.6 根癌农杆菌介导的菜心遗传转化体系的优化培养基
3.2 方法
3.2.1 菜心遗传转化系统的初步探索
3.2.1.1 种子的消毒处理
3.2.1.2 外植体的获取和培养
3.2.1.3 不同浓度gelzan含量对于不定芽诱导的影响
3.2.1.4 不同浓度AgNO3对菜心不定芽诱导的影响
3.2.1.5 不同激素组合对菜心不定芽诱导的影响
3.2.3 菜心遗传转化系统的初步探索
3.3 结果与分析
3.3.1 菜心不定芽再生体系的建立
3.3.1.1 Gelzan植物凝胶对不定芽诱导的影响
3.3.1.2 AgNO3对菜心不定芽诱导的影响
3.3.1.3 激素浓度对不定芽诱导的影响
3.3.2 菜心遗传转化体系的建立
3.4 小结
3.4.1 菜心不定芽再生体系的建立
3.4.2 菜心遗传转化系统的初步探索
4 菜心CRISPR-Cas9系统的初步探索
4.1 材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 质粒和菌株
4.1.3 TCP14基因的sgRNA1和sgRNA2和pAtU6引物的合成
4.1.4 实验仪器
4.1.5 实验试剂及配制
4.1.6 大肠杆菌和农杆菌培养所用的培养基
4.2 方法
4.2.1 设计sgRNA靶标序列
4.2.2 sgRNA Oligo二聚体的制备
4.2.3 质粒酶切与产物连接
4.2.4 质粒转化DH5a大肠杆菌感受态
4.2.5 提取重组质粒
4.2.6 重组质粒转化农杆菌(冻融法)
4.2.7 菌液PCR鉴定阳性转化子
4.3 结果与分析
4.3.1 CRISPR-Cas9载体的构建
4.4 小结
5 总结与讨论
参考文献
附录
附录A 主要试剂
附录B 仪器
附录C 白菜TCP转录因子的信息和分类情况
附录D 本研究所用的引物
致谢
本文编号：3749594
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