深海狮子鱼Hsp90的原核表达、纯化与鉴定

发布时间：2023-04-01 06:15

　　热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是一类单体分子量90kD左右的分子伴侣蛋白,广泛存在于原核和真核生物中。该类蛋白高度保守,且在细胞中含量丰富,为细胞生存所必需,参与折叠及调控多种与信号转导及细胞周期调控相关的蛋白,在维持蛋白质稳态中发挥重要作用。因其顾客蛋白(Client proteins)多与细胞增殖及肿瘤进展相关,Hsp90成为抗肿瘤药物设计的关键靶点。Hsp90在真核细胞中有α和β两个亚型,以α-α或β-β的二聚体形式发挥活性。其N端为ATP结合结构域,具有ATP酶活性,可与抑制剂或辅分子伴侣结合;中间结构域主要与顾客蛋白及辅分子伴侣结合;C端结构域主要负责其二聚化。已有电镜及晶体结构解析表明,Hsp90功能的发挥通过其N端结合ATP驱动瞬时的二聚化及ATP水解后二聚化打开的这种由闭合到开放状态的构象变化完成。生活在海平面7000m以下的马里亚纳海沟的一种深海狮子鱼(Pseudoliparis swirei)的基因组中,hsp90基因有五个拷贝,且其中四个拷贝均在N端结构域的一保守位点发生了重复性固定突变。据同源建模结果分析,该突变位点紧邻...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 蛋白质折叠
    1.2 分子伴侣协助蛋白质折叠
    1.3 热休克蛋白家族简介
        1.3.1 smHSPs组成结构与功能简介
        1.3.2 HSP40s组成结构与功能简介
        1.3.3 HSP60s组成结构与功能简介
        1.3.4 HSP70s概述
            1.3.4.1 Hsp70结构特征
            1.3.4.2 Hsp70功能简介
            1.3.4.3 Hsp70辅助蛋白介绍
        1.3.5 HSP90s概述
            1.3.5.1 Hsp90结构特征
            1.3.5.2 Hsp90功能介绍
            1.3.5.3 Hsp90与客户蛋白和辅分子伴侣间的相互作用
            1.3.5.4 Hsp90 构象循环具有ATP依赖性
        1.3.6 HSP100s组成结构与功能简介
    1.4 关于深海狮子鱼(Hadal snailfish)Hsp90 研究现状
    1.5 小结
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 基因、质粒和菌株
        2.1.2 实验试剂与耗材
        2.1.3 主要实验仪器
        2.1.4 主要溶液配方
    2.2 蛋白表达系统的比较与选择
        2.2.1 常见蛋白表达系统介绍
        2.2.2 蛋白表达系统的选择
    2.3 蛋白表达载体的选择
    2.4 RNA反转录与PCR扩增获取目的基因
    2.5 构建重组载体
        2.5.1 双酶切目的基因和质粒
        2.5.2 目的片段和质粒进行连接
    2.6 克隆重组载体
        2.6.1 转化感受态细胞
        2.6.2 菌落PCR及测序验证
        2.6.3 摇菌及小提质粒
    2.7 重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞并进行验证
    2.8 目的蛋白的诱导表达
    2.9 蛋白纯化
        2.9.1 蛋白纯化常用方法介绍
        2.9.2 His-Tag融合蛋白Hsp90 的纯化
        2.9.3 Strep-tagII融合蛋白Hsp90 的纯化
    2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
    2.11 蛋白质印迹法(Western Blot)验证目的蛋白的表达
    2.12 蛋白质谱鉴定
    2.13 Hsp90 蛋白ATPase活性的测定
    2.14 电镜观察蛋白状态并进行初步三维重构
        2.14.1 负染色技术概述及原理
        2.14.2 负染制样流程
        2.14.3 数据采集
        2.14.4 数据处理并做初步三维重构
第三章 结果与分析
    3.1 hsp90基因重组载体构建结果
        3.1.1 含His-tag序列的hsp90 基因重组载体构建结果
        3.1.2 含Strep-tag II序列的hsp90 基因重组载体构建结果
    3.2 His-tag融合蛋白Hsp90 表达纯化结果
        3.2.1 WB验证与质谱鉴定Hsp90蛋白表达情况
            3.2.1.1 WB验证结果
            3.2.1.2 质谱鉴定结果
        3.2.2 Hsp90蛋白纯化结果
            3.2.2.1 Ni柱纯化结果
            3.2.2.2 阴离子交换层析(QHP柱)纯化结果
            3.2.2.3 分子排阻层析纯化结果
    3.3 Strep-tag II融合蛋白Hsp90 表达纯化结果
        3.3.1 Strep柱纯化结果
        3.3.2 WB验证及质谱鉴定Hsp90蛋白表达情况
        3.3.3 阴离子交换层析(QHP柱)纯化结果
    3.4 小批量菌对照实验的实验结果
    3.5 Hsp90 蛋白ATP酶活性测定
    3.6 Hsp90蛋白的初步三维重构
    3.7 小结
第四章 结果讨论与研究展望
    4.1 结果讨论
    4.2 研究展望
参考文献
在学期间研究成果
致谢



本文编号：3776600