斑马鱼消化器官发育缺陷突变体的遗传筛选

发布时间：2017-05-19 05:06

  本文关键词：斑马鱼消化器官发育缺陷突变体的遗传筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：作为脊椎动物体内非常重要的系统之一,消化系统,一直以来都是生物学、医学领域关注的焦点。消化系统能否正常发挥生理功能关乎到个体的健康,一些严重的消化系统疾病直接威胁着人们的健康。消化系统由消化道和消化腺组成。肝脏、胆囊、肠道等都是非常重要的消化器官,影响着食物消化、贮存、吸收营养、排泄和内分泌等各个方面。研究消化器官的发育过程,有助于人们了解消化器官的分子发育机制进而了解一些先天性消化器官发育缺陷疾病的分子机制,比如先天性肝硬化、先天性肝内胆管闭锁、巨结肠症,十二指肠闭锁症等。由于这些先天性疾病的患者通常在胚胎期或者婴儿期就会过早的死亡,这使得在研究先天性消化器官发育缺陷分子机制上缺少必要的临床案例和疾病家系。斑马鱼为小型亚热带淡水鱼类,是在脊椎动物中具有代表性的模式动物。它在基因组层面上与人类、小鼠等高等哺乳动物相似度极高。斑马鱼的消化器官包括肝脏、胆囊、肠道等,与高等脊椎动物结构上类似。长期以来,斑马鱼因其具有体外受精、胚胎透明和遗传操作方便等独特优势,成为研究脊椎动物胚胎发育的理想模型。斑马鱼易于饲养,并在三个月左右达到性成熟。雌鱼每周可产数百粒卵,非常适合作大规模遗传筛选。肠道、肝脏和胆囊都发育自内胚层,但是我们对于三者发育过程中分子机制的联系和差异并不清楚。为了探究这个问题,我们利用斑马鱼为模式动物进行无基因差别的正向遗传筛选,获得相应消化器官发育缺陷的突变体,同时利用二代测序方法筛选野生型斑马鱼体内这些消化器官的组织特异性基因。主要研究内容为：1.正向遗传筛选斑马鱼消化器官发育缺陷突变体,首先是ENU诱变野生型斑马鱼与F1的生产及F2筛选家族的建立,其次是F2家族的遗传筛选及突变体的传代,最后是F3家族的遗传筛选及候选突变体表型分型：2.消化器官转录组分析、特异性基因鉴定等研究,首先我们提取野生型斑马鱼消化器官样品RNA,然后送公司测序,最后对公司的数据进行分析筛选找出组织特异性的表达基因并做进一步的探究。斑马鱼消化器官发育缺陷突变体正向遗传筛选的研究,可以获得相应消化器官发育缺陷的动物模型,这将有助于深入了解斑马鱼消化器官分子发育的过程以及不同消化器官之间分子发育的联系；斑马鱼消化器官转录组测序有助于探寻各消化器官之间时空表达特异性的基因,为研究该消化器官分子发育过程提供重要证据。在正向遗传筛选中,我们采取经典的ENU诱变流程和三代法筛选策略。在F2家族筛选中,家族内部雌雄个体相互交配的方法产生F3子代,我们利用Ifabp探针原位杂交和BES-H2O2-Ac染色的方法观察确定肝脏、胆囊和肠道在F3子代的表型,根据孟德尔遗传定律判定其父母是不是杂合突变体,将观察到有发育缺陷的且符合遗传定律的定为候选突变体。然后将F2代筛选获得的候选突变体与野生型杂交产生F3家族,采用同样的筛选方法在F3家族中验证F2代候选突变体的表型是否可遗传,如可稳定遗传则定义为F3候选突变体。根据突变体的表型(结合同期检测的肝脏、肠道、胆囊等表型),相同或相似的归为一类。最终,我们在128个突变基因组筛选中筛出了源自14个F2家族的40对(最终存活34对)斑马鱼消化器官发育缺陷候选突变体,并将候选突变体进行了表型归类,确定为23个突变品系,大致分成了以下6种突变类型,第一类被称为“肠道特异性缺陷突变体”,有1个突变品系属于这一类型；第二类被称为“肝脏特异性缺陷突变体”,有6个突变品系属于这一类型；第三类被称为“胆囊特异性缺陷突变体”,有7个突变品系属于这一类型；第四类被称为“肝脏和胆囊共同发育缺陷突变体”,有1个突变品系属于这一类型；第五类为“肠道和胆囊共同发育缺陷突变体”,有4个突变品系属于这一类型；第六类被称为“肝、肠、胆共同发育缺陷突变体”,有4个突变品系属于这一类。在消化器官转录组测序中,我们利用二代测序的方法获得了斑马鱼肝脏、胆囊、全肠、肠的不同节段(前肠、中肠、小肠、直肠和肛门)、胚胎期5dpf消化器官及身体组织、成鱼消化器官及身体组织的转录组数据,并初步分析了肠的不同节段及身体组织的数据,获得了6种不同表达模式的基因归类,分别代表身体、肛门、小肠、前中肠、中小肠特异高表达基因及消化道逐级降低表达基因,6个基因归类的gene ontology分析,以及人类消化器官特异性高表达基因与测序数据的对比表明,斑马鱼的肠道与人类消化道的基因表达谱高度相似,但是斑马鱼没有独立结构的胃,深入的分析及实验验证将在以后进行。同时我们又将肝脏、胆囊和肠道三者的差异表达基因进行了对比,分别找出了在这三种消化器官中上调和下调的组织特异性表达基因。最终,本研究通过遗传筛选F2家族和F3家族,获得肝脏、胆囊和肠道中具有稳定遗传的23个发育缺陷突变体,为探究消化器官发育过程中的分子机制提供了动物模型,未来将会挑选出2-3个突变体建立Mappings家族,通过后续图位克隆找出突变基因以便探究其发育的分子机制；本研究通过消化器官转录组学的数据分析,筛选出若干在肝脏、胆囊和肠道中组织特异性表达的基因,今后会利用反向遗传学手段(基因敲除)来研究其在相应消化器官中的分子发育机制,同时结合正向遗传筛选结果完善对相应消化器官分子发育过程的认识。
【关键词】：斑马鱼 ENU 遗传筛选 突变体 转录组学
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q344
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文献综述13-20
• 1.1 斑马鱼早期消化系统发育的研究进展13-17
• 1.1.1 斑马鱼肝脏发育的过程13-14
• 1.1.2 斑马鱼肠道发育的过程14-16
• 1.1.3 斑马鱼胆囊发育的过程16-17
• 1.2 遗传诱变的介绍17-18
• 1.2.1 ENU诱变的简介17
• 1.2.2 ENU诱变的特性与优势17-18
• 1.2.3 以斑马鱼作为模式生物及筛选材料的优势18
• 1.3 转录组学的研究进展18-20
• 1.3.1 转录组学及比较转录组学概述18-19
• 1.3.2 转录组学研究方法的发展19-20
• 第二章 引言20-23
• 2.1 本研究工作的目的和意义20-21
• 2.2 本研究工作研究内容和预期结果21-23
• 2.2.1 本研究工作的研究内容21-22
• 2.2.2 本研究工作预期结果22-23
• 第三章 研究对象、实验材料和研究方法23-47
• 3.1 斑马鱼品系及饲养23-24
• 3.1.1 斑马鱼简介23
• 3.1.2 斑马鱼饲养23-24
• 3.2 实验仪器、试剂以及耗材24-26
• 3.2.1 实验仪器24-25
• 3.2.2 实验试剂25
• 3.2.3 实验耗材25-26
• 3.3 试剂配制26-31
• 3.3.1 全胚RNA原位杂交(Whole mount RNA in situ hybridization)相关试剂26-29
• 3.3.2 分子克隆操作相关试剂29-31
• 3.4 菌株和质粒31
• 3.5 Taq DNA polymerase的制备与提纯31-32
• 3.6 MgCl_2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞32
• 3.7 斑马鱼RNA的提取以及cDNA的合成32-34
• 3.7.1 斑马鱼RNA的提取32-33
• 3.7.2 斑马鱼1st-Strand cDNA合成33-34
• 3.8 含目的基因的重组质粒的构建34-39
• 3.8.1 扩增目的基因片段34
• 3.8.2 目的片段PCR产物纯化34-36
• 3.8.3 T载体与目的片段连接重组36
• 3.8.4 重组子的转化(Transformation)36-37
• 3.8.5 菌落PCR筛选阳性重组子37-38
• 3.8.6 阳性重组质粒的纯化38-39
• 3.8.7 重组质粒的鉴定及测序39
• 3.9 用于原位杂交的反义RNA探针的制备39-41
• 3.9.1 线性化反义RNA探针模板39-40
• 3.9.2 纯化RNA探针模板40-41
• 3.9.3 探针合成及纯化41
• 3.10 斑马鱼早期胚胎RNA原位杂交(Whole mount RNA in situ hybridization)41-43
• 3.10.1 早期胚胎的收集、固定及保存41-42
• 3.10.2 全胚原位杂交流程42-43
• 3.11 ENU诱变及遗传筛选流程43-45
• 3.11.1 ENU处理野生型斑马鱼43
• 3.11.2 ENU遗传筛选的基本策略43-44
• 3.11.3 本研究中的遗传筛选方法44-45
• 3.12 野生型斑马鱼消化器官转录组测序45-47
• 3.12.1 野生型斑马鱼消化器官RNA样品获取45
• 3.12.2 转录组测序基本策略及方法45-47
• 第四章 实验结果47-56
• 4.1 筛选突变体方法的可行性验证47-49
• 4.1.1 BES-H_2O_2-Ac在野生型斑马鱼体内标记情况47-48
• 4.1.2 lfabp探针合成及在野生型斑马鱼体内的表达情况48-49
• 4.2 ENU诱变与F2家族的建立49-54
• 4.2.1 F2代筛选与突变体的传代49-50
• 4.2.2 F3代建立与筛选50-51
• 4.2.3 F3突变体的表型分类51-54
• 4.3 消化器官转录组样品获取及初步分析54-56
• 4.3.1 斑马鱼消化器官转录组样品获取54
• 4.3.2 转录组数据的初步分析54-56
• 第五章 结果讨论与分析56-58
• 5.1 ENU遗传筛选工作成果讨论56
• 5.2 ENU遗传筛选过程中的一些问题56-58
• 第六章 结论与展望58-60
• 6.1 斑马鱼肠道、肝脏和胆囊突变体的正向遗传筛选58
• 6.2 斑马鱼消化器官转录组测序58-60
• 参考文献60-68
• 致谢68-70
• 附录70-81
• 在读期间发表论文及参与课题81
• 发表论文81
• 参与项目81
• 参与其他课题81

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