VDR敲除小鼠睾丸组织转录组学分析及脂代谢相关基因筛选研究

发布时间：2023-04-02 04:42

　　VDR(Vitamin D Receptor,VDR)是转录因子核受体家族的成员,主要通过调控靶基因的表达,参与调节钙与磷酸盐代谢、骨骼发育、脂代谢、细胞增殖分化、神经系统发育、免疫调节,抗肿瘤发生和生殖调控等多种生物学功能。实验室前期构建了VDR敲除鼠,发现VDR敲除后小鼠生殖能力显著下降,脂肪合成减少。基于此,本研究采用Illumina Hiseq测序平台,对6月龄和12月龄的VDR敲除型和野生型小鼠睾丸组织进行了转录组学分析,以期在睾丸组织中筛选出受VDR调控的与脂代谢相关的相关基因。在获得脂代谢基因SCD-1(stearoyl-coA desaturase1,SCD-1)后,利用RT-q PCR技术对SCD-1基因进行组织表达谱分析,然后采用细胞免疫化学染色方法分析SCD-1在睾丸组织不同类型细胞中的表达水平和细胞定位,最后基于VDR和筛选的脂代谢基因SCD-1的超表达和干扰实验,通过RT-qPCR和Western blot技术在小鼠睾丸间质细胞探究了VDR和SCD-1的互调关系。本研究获得了小鼠睾丸组织中VDR调控的脂代谢基因,并初步分析了VDR与SCD-1之间的相互影响关系...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 维生素D受体
        1.1.1 维生素D与维生素D受体
        1.1.2 VDR基因组及非基因组效应
        1.1.3 VDR的生物学功能及相关疾病
        1.1.4 VDR与脂代谢
        1.1.5 VDR与生殖
    1.2硬脂酰辅酶A去饱和酶1
        1.2.1 SCD-1 的发现与结构
        1.2.2 SCD-1 的表达调控
        1.2.3 SCD-1 的生物学功能
        1.2.4 SCD-1 与脂代谢
    1.3 转录组分析研究进展
    1.4 研究的目的及意义
第2章 转录组测序质量分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 参考基因组基本信息统计
    2.2 实验方法
        2.2.1 总RNA提取与检测
        2.2.2 cDNA合成与文库富集
        2.2.3 文库质检
        2.2.4 转录组测序
        2.2.5 原始数据整理
        2.2.6 原始数据过滤
        2.2.7 参考基因组基因功能注释整理
        2.2.8 比对分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 RNA提取与检测
        2.3.2 测序质量分析
        2.3.3 数据组装与参考注释
        2.3.4 测序数据比对
    2.4 讨论
    2.5 小结
第3章 睾丸组织转录组分析及脂代谢相关基因筛选
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 基因表达量分析
        3.2.2 基因表达差异分析
        3.2.3 多组差异表达基因比较分析
        3.2.4 热图聚类分析
        3.2.5 差异表达基因GO富集分析
        3.2.6 差异表达基因KEGG富集分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 不同样本睾丸组织基因表达量
        3.3.2 不同样本睾丸组织差异基因统计
        3.3.3 表达差异基因分析
        3.3.4 6月龄和12 月龄共同差异表达基因分析
        3.3.5 差异表达基因GO富集分析
        3.3.6 差异表达基因KEGG富集分析
        3.3.7 VDR-/-和WT小鼠睾丸组织脂代谢差异基因统计
        3.3.8 VDR-/-和WT小鼠睾丸组织脂代谢差异表达基因表达模式
        3.3.9 小鼠睾丸组织脂代谢相关共差异表达基因筛选
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 VDR对小鼠睾丸组织SCD-1 基因表达的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物及细胞
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 细胞免疫荧光染色检测SCD-1 表达定位
        4.2.2 Real-time qPCR
        4.2.3 构建SCD-1 超表达载体
        4.2.4 构建VDR超表达载体
        4.2.5 重组载体表达分析
        4.2.6 干扰表达分析
        4.2.7 细胞培养
        4.2.8 Western blot
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 野生型和VDR敲除型小鼠SCD-1 基因的组织差异表达
        4.3.2 SCD-1 基因在睾丸组织细胞系(TM3、GC-1、C18-4)的表达定位
        4.3.3 SCD-1 过表达载体的构建
        4.3.4 EGFP-VDR融合表达载体构建与验证
        4.3.5 TM3 细胞中过表达VDR对 SCD-1 表达的影响
        4.3.6 TM3 细胞中干扰VDR对 SCD-1 表达的影响
        4.3.7 TM3 细胞中SCD-1 负向调节VDR表达
    4.4 讨论
    4.5 小结
结论
参考文献
附录 (试剂配制)
攻读硕士期间取得的科研成果
致谢



本文编号：3778558