Tg（oct4：EGFP）转基因斑马鱼的制备及快速纯化的方法

发布时间：2023-04-09 02:11

　　OCT4在胚胎早期发育,尤其是维持细胞多能性等方面具有重要调节作用。斑马鱼是重要的模式生物,建立荧光标记oct4基因鱼为开展鱼类干细胞研究和应用奠定基础。本文通过构建带有TOL2转座子的PBLK-oct4-EGFP质粒,获得了绿色荧光标记oct4基因的转基因鱼(F0代);结合雌核发育技术,建立了一种快速制备纯合转基因鱼的方法。具体研究结果如下:1、克隆斑马鱼oct4基因的启动子片段,对PBLK质粒骨架和带有oct4启动子的pMD18-T-oct4质粒同时进行双酶切,利用T4连接酶将oct4启动子连接到酶切后的PBLK质粒上,成功构建了全长为7338bp的带有TOL2转座子的PBLK-oct4-EGFP融合蛋白质粒。2、将PBLK-oct4-EGFP质粒和TOL2转座酶mRNA混合液显微注入斑马鱼受精卵中,获得约53%的绿色荧光胚胎(F0代)。荧光定量PCR对oct4和egfp基因在F0代胚胎中的表达分析表明:斑马鱼oct4基因具有母源性基因表达的特点,合子核基因在囊胚期表达旺盛,随着胚胎细胞的分化,oct4基因表达量随之降低。筛选到的F0代斑马鱼卵巢组织中的卵细胞及产出卵子中均可观察到...

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 Oct4基因研究进展
        1.1.1 Oct4基因的结构
        1.1.2 Oct4基因的生物学功能
    1.2 绿色荧光蛋白基因研究进展
        1.2.1 绿色荧光蛋白基因的发现及结构及特点
        1.2.2 绿色荧光蛋白基因的应用
    1.3 转基因鱼研究
        1.3.1 转基因动物研究意义及现状
        1.3.2 转基因鱼的制备方法
        1.3.3 Tol2转座子及其应用
    1.4 研究目的和意义
第二章 材料及方法
    2.1 斑马鱼和红鲫的人工繁殖及胚胎培育
        2.1.1 斑马鱼的人工繁殖及胚胎培育
        2.1.2 红鲫的人工繁殖及胚胎培育
    2.2 斑马鱼oct4基因启动子的获取
        2.2.1 斑马鱼尾鳍DNA提取
        2.2.2 PCR扩增启动子及PCR产物纯化
    2.3 PBLK-oct4-EGFP质粒的构建及鉴定
        2.3.1 限制性内切酶反应
        2.3.2 酶连反应
        2.3.3 重组PBLK-oct4-EGFP质粒的转化
        2.3.4 菌落PCR
        2.3.5 测序
        2.3.6 质粒扩增
        2.3.7 小提质粒
    2.4 转座酶mRNA的制备
        2.4.1 pCS-TP质粒酶切
        2.4.2 体外转录
    2.5 显微注射
    2.6 egfp和 oct基因在早期胚胎的表达量检测
        2.6.1 提取及检测总RNA
        2.6.2 RNA反转录为c DNA
        2.6.3 实时荧光定量PCR
    2.7 冰冻切片
    2.8 斑马鱼的雌核发育方法
        2.8.1 红鲫精子的灭活
        2.8.2 斑马鱼的雌核发育及倍性操作
        2.8.3 斑马鱼的雌核发育的鉴定
    2.9 细胞培养
        2.9.1 细胞培养基
        2.9.2 细胞的原代培养
        2.9.3 细胞的传代培养
        2.9.4 细胞的冻存
第三章 结果与分析
    3.1 获得PBLK-oct4-EGFP融合蛋白表达载体
        3.1.1 构建PBLK-oct4-EGFP质粒
        3.1.2 TOL2 转座酶m RNA的制备
    3.2 Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼F0 代的建立
        3.2.1 显微注射后斑马鱼胚胎发育观察
        3.2.2 egfp和 oct4 基因在早期胚胎的表达量分析
        3.2.3 转基因斑马鱼F0代的筛选及鉴定
    3.3 Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼雌核发育F1 代纯合体的建立与鉴定
        3.3.1 转基因斑马鱼雌核发育F1代的制备
        3.3.2 转基因斑马鱼雌核发育F1代纯合个体的鉴定..
    3.4 Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼纯合个体尾鳍细胞系的建立
第四章 讨论与总结
参考文献
致谢



本文编号：3786873