Ly6基因家族新成员—斑马鱼Lypc的表达模式及功能研究

发布时间：2017-05-20 13:19

  本文关键词：Ly6基因家族新成员—斑马鱼Lypc的表达模式及功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Ly6/uPAR/CD59/netuotoxin基因超家族(Ly6SF)存在于很多后生动物中,基因功能较为多样化。Ly6家族被称作淋巴抗原6或蛇毒素家族,保守的ly6/uPAR(LU)结构域包含了8到10个半胱氨酸构成的四至五对保守的二硫键,形成三指蛋白结构域(three-fingered protein domain, TFPD),家族成员具有序列保守性低,进化速度快,成员数量庞大并且功能多样化等特点。果蝇、小鼠、人中的部分Ly6家族成员表达和功能已有定论,但迄今为止,Ly6基因超家族在胚胎发育中的研究较少。本实验以模式动物斑马鱼为研究对象,本实验室前期已经通过大量比对斑马鱼基因组的方法,搜寻到了位于不同染色体上的具有LU结构域的多个基因,已确定部分基因在侧线神经簇、表皮、松果体、离子通道等部位特异表达,表达分布的多样性提示Ly6基因超家族在斑马鱼中与在人类中一样,也能执行各种各样的功能。本研究从已鉴定的Ly6家族成员中筛选出其中一个基因进行了初步的探究,基因定位于斑马鱼的15号染色体(XP_003200124)上,因为序列的不保守性,无法确定其直线同源基因,故根据其表达部位为色素细胞,命名为Lypc。通过同源建模、序列比对、功能域分析等生物信息学工具分析了Lypc的特性。Lypc基因由三个外显子组成,其cDNA含有一个381bp的开放阅读框,氨基端有明显的信号肽,编码126个氨基酸残基的GPI锚定蛋白,其中包含一个LU domain/三指蛋白结构域,具有Ly6基因超家族的典型特征。斑马鱼胚胎原位杂交及石蜡切片的结果显示：这个基因的表达具有组织特异性。胚胎早期几乎没有表达,发育到38小时以后才有明显的特异性表达,主要表达于表皮色素细胞以及视网膜表皮色素细胞,而不在深层细胞。说明Lypc可能在色素细胞出现后才开始表达。实时定量RT-PCR结果表明Lypc的表达量还在成年斑马鱼不同组织表现出了较大的差异,在皮肤、眼睛、肠道中的表达量较高,而在肌肉、肝脏、鳃中几乎没有表达。突变体Casper中Lypc在躯干上的表达缺失,表明Lypc在皮肤上的表达主要集中在色素细胞中。实时定量PCR的结果显示Lypc的表达量受到光照黑暗交替的昼夜节律影响,呈现昼夜不同的表达模式,并且黑暗环境的调控与其表达呈正相关关系。进一步的过表达实验并未胚胎发育有明显异常。为了继续探究Lypc的功能,我们构建了rALENs敲除载体,进行基因敲除实验,目前纯合突变体的筛选工作正在进行中。Lypc基因的研究为Ly6基因超家族在胚胎发育中的表达模式及其功能探索提供了一定的理论依据。
【关键词】：斑马鱼 Ly6基因超家族 色素细胞 视网膜 昼夜节律
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-24
• 1 Ly6基因超家族概述11-13
• 1.1 Ly6基因超家族基因的功能11-13
• 2. Ly6家族的特有结构——三指蛋白13-14
• 3. 斑马鱼的色素细胞14-18
• 3.1. 斑马鱼的虹彩细胞15-17
• 3.2 斑马鱼视网膜色素细胞17-18
• 4. 斑马鱼的生物节律研究18-21
• 4.1 光照对斑马鱼生物周期的影响18-21
• 5. 研究Lypc的目的和意义21-24
• 第二章：实验材料和方法24-60
• 1 实验材料24-25
• 1.1 斑马鱼24
• 1.2 实验试剂24-25
• 1.3 实验仪器25
• 2 实验方法25-60
• 2.1 斑马鱼Lypc原位杂交体外探针合成25-33
• 2.2 斑马鱼胚胎整体原位杂交33-37
• 2.3 斑马鱼Lypc石蜡切片37-38
• 2.4 原位杂交后冰冻切片制作38
• 2.5 斑马鱼Lypc mRNA的过表达38-45
• 2.6 斑马鱼胚胎总RNA的提取45-46
• 2.7 反转录46
• 2.8 半定量PCR46-47
• 2.9 实时定量PCR(Real time-PCR)47-49
• 2.10 构建类转录激活因子效应物(TALEN)质粒载体49-55
• 2.11 TALEN显微注射及突变体选育55-57
• 2.12 Lypc生物节律实验57-58
• 2.13 LPS处理胚胎Real-Time实验58-59
• 2.14 Lypc基因及其编码蛋白的生物信息学分析59-60
• 第三章：实验结果60-78
• 1 斑马鱼Lypc基因序列结构分析60-78
• 1.1 Lypc基因编码的的一级结构60
• 1.2 信号肽预测60-61
• 1.3 结构域预测61
• 1.4 GPI锚定信号预测61-62
• 1.5 蛋白质序列比对62-63
• 1.6 Lypc蛋白结构的同源建模63
• 1.7 Lypc基因在斑马鱼中的表达模式63-72
• 1.8 Lypc的功能研究72-78
• 第四章 ：讨论78-81
• 1 斑马鱼中的Lypc为Ly6家族成员78
• 2 Lypc基因的表达模式78-79
• 3 Lypc基因的功能预测79-81
• 结论81-82
• 参考文献82-88
• 附录88-89
• 致谢89-90
• 个人简历90-91
• 发表的学术论文91

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