促进染色质转录因子亚基Pob3调控嗜热四膜虫有性生殖过程
发布时间：2023-11-11 18:20
真核生物的组蛋白与DNA构成核小体,继而压缩形成染色质。但这种复杂构象确实会影响了DNA的复制,转录和修复等活动。促进染色质转录因子(Facilitate Chromatin Transcription,FACT)复合物是H2A-H2B的结合伴侣,由SPT16和POB3/SSRP1这2个亚基构成,能够影响基因的复制,转录和修复等活动。嗜热四膜虫具有特殊的核发育阶段,为了解组蛋白伴侣在染色质装配中如何发挥作用提供了可能。本文对FACT的亚基Pob3在四膜虫中的功能展开了详尽的研究。结果如下:1.嗜热四膜虫中POB3基因生物信息学分析促进染色质转录复合物FACT由SPT16和POB3/SSRP1这2个亚基构成,且POB3和SPT16这2个亚基存在协同进化。实时荧光定量PCR发现,POB3在整个结合生殖的表达量较高,并在6 h达到顶峰,不过,在营养生长以及饥饿时期表达水平很低。2.HA-Pob3定位在小核和大核为了研究Pob3在四膜虫细胞中的定位,构建了包含HA-Tag的质粒pXS75-POB3。免疫荧光定位表明,HA-Pob3在生长,饥饿和接合生殖时期都定位在小核和大核,其中凋亡的亲本大核...
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 组蛋白分子伴侣的概述
1.2 组蛋白伴侣FACT的功能
1.3 组蛋白伴侣FACT的组成及结构
1.4 嗜热四膜虫概述
1.5 本课题的研究意义
第二章 嗜热四膜虫中POB3 基因的生物信息学分析
2.1 材料
2.1.1 细胞株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 试剂的配制
2.1.4 实验仪器
2.1.5 引物
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿和交配
2.2.3 嗜热四膜虫RNA的提取
2.2.4 cDNA的合成
2.2.5 POB3 基因的表达谱分析
2.3 结果
2.3.1 Pob3和Spt16 的聚类分析
2.3.2 POB3 表达谱分析
2.3.3 Pob3 蛋白序列分析
2.4 讨论
第三章 嗜热四膜虫中POB3 亚细胞定位及入核机制
3.1 材料
3.1.1 质粒和细胞株
3.1.2 试剂
3.1.3 试剂的配制
3.1.4 引物
3.1.5 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 嗜热四膜虫的培养、饥饿及配对
3.2.2 重组质粒pXS-POB3 的构建
3.2.3 重组质粒pXS-POB3F3A,pXS-POB3△33,pXS-POB3△87 的构建
3.2.4 嗜热四膜虫基因枪转化
3.2.5 突变株的筛选
3.2.6 嗜热四膜虫基因组的提取
3.2.7 Western blot
3.2.8 间接免疫荧光定位
3.3 结果
3.3.1 HA-Pob3 定位在大核和小核
3.3.2 Pob3的C端芳香族氨基酸不影响蛋白定位模式
3.3.3 Pob3的N端结构域和C端结构域一同参与蛋白定位
3.4 讨论
第四章 POB3 敲减抑制了嗜热四膜虫配子核和合子核的有丝分裂
4.1 材料
4.1.1 细胞株和质粒
4.1.2 试剂
4.1.3 引物
4.1.4 实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 嗜热四膜虫的培养、饥饿和配对
4.2.2 重组质粒pNeo-POB3 的构建
4.2.3 重组质粒p POB3hpNEO的构建
4.2.4 嗜热四膜虫基因枪转化
4.2.5 突变株的筛选
4.2.6 实时荧光定量PCR
4.2.7 有性生殖时期细胞核的观察
4.2.8 活细胞染色观察
4.3 结果
4.3.1 KO-POB3 突变株的鉴定
4.3.2 i-POB3 突变株的鉴定
4.3.3 POB3 敲减影响了细胞增殖速率
4.3.4 POB3 敲减抑制了嗜热四膜虫合子核和配子核的有丝分裂
4.3.5 POB3 敲减不影响亲本大核的程序化降解
4.4 讨论
参考文献
总结与展望
附录
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式
本文编号：3863076
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 组蛋白分子伴侣的概述
1.2 组蛋白伴侣FACT的功能
1.3 组蛋白伴侣FACT的组成及结构
1.4 嗜热四膜虫概述
1.5 本课题的研究意义
第二章 嗜热四膜虫中POB3 基因的生物信息学分析
2.1 材料
2.1.1 细胞株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 试剂的配制
2.1.4 实验仪器
2.1.5 引物
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿和交配
2.2.3 嗜热四膜虫RNA的提取
2.2.4 cDNA的合成
2.2.5 POB3 基因的表达谱分析
2.3 结果
2.3.1 Pob3和Spt16 的聚类分析
2.3.2 POB3 表达谱分析
2.3.3 Pob3 蛋白序列分析
2.4 讨论
第三章 嗜热四膜虫中POB3 亚细胞定位及入核机制
3.1 材料
3.1.1 质粒和细胞株
3.1.2 试剂
3.1.3 试剂的配制
3.1.4 引物
3.1.5 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 嗜热四膜虫的培养、饥饿及配对
3.2.2 重组质粒pXS-POB3 的构建
3.2.3 重组质粒pXS-POB3F3A,pXS-POB3△33,pXS-POB3△87 的构建
3.2.4 嗜热四膜虫基因枪转化
3.2.5 突变株的筛选
3.2.6 嗜热四膜虫基因组的提取
3.2.7 Western blot
3.2.8 间接免疫荧光定位
3.3 结果
3.3.1 HA-Pob3 定位在大核和小核
3.3.2 Pob3的C端芳香族氨基酸不影响蛋白定位模式
3.3.3 Pob3的N端结构域和C端结构域一同参与蛋白定位
3.4 讨论
第四章 POB3 敲减抑制了嗜热四膜虫配子核和合子核的有丝分裂
4.1 材料
4.1.1 细胞株和质粒
4.1.2 试剂
4.1.3 引物
4.1.4 实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 嗜热四膜虫的培养、饥饿和配对
4.2.2 重组质粒pNeo-POB3 的构建
4.2.3 重组质粒p POB3hpNEO的构建
4.2.4 嗜热四膜虫基因枪转化
4.2.5 突变株的筛选
4.2.6 实时荧光定量PCR
4.2.7 有性生殖时期细胞核的观察
4.2.8 活细胞染色观察
4.3 结果
4.3.1 KO-POB3 突变株的鉴定
4.3.2 i-POB3 突变株的鉴定
4.3.3 POB3 敲减影响了细胞增殖速率
4.3.4 POB3 敲减抑制了嗜热四膜虫合子核和配子核的有丝分裂
4.3.5 POB3 敲减不影响亲本大核的程序化降解
4.4 讨论
参考文献
总结与展望
附录
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式
本文编号：3863076
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