荧光假单胞菌2P24中MarR家族转录因子SlyA调控机制和功能的研究
发布时间：2024-12-06 23:13
MarR家族是一种广泛存在于古菌和细菌中古老而重要的转录调节因子,在应激条件下负责基因表达的调控。SlyA蛋白是属于MarR家族的转录因子,在多种致病菌中调控菌体在宿主内的生存能力和毒力因子的表达。而荧光假单胞菌属于重要的生防菌,其SlyA蛋白的调节机制和功能却鲜有报道。本文的研究以调节外排泵EmhABC的转录因子EmhR和SlyA存在共适应性为切入点,探究了荧光假单胞菌2P24中SlyA的调控机制和功能。我们发现SlyA可以调节EmhABC基因的表达,荧光假单胞菌2P24的slyA敲除株对部分抗生素的抗性降低了。而且SlyA是负调控自身基因表达的转录调控因子。SlyA以结合在被其调控基因的启动子的方式激活或抑制被调控基因的表达,其特异性识别结合的DNA序列通式为伪回文序列TTA-N6-TAA。本文也寻找了荧光假单胞菌2P24基因组中启动子区含有TTA-N6-TAA的基因,作为SlyA调控的候选基因。质谱数据分析显示slyA基因敲除株与phoP基因敲除株蛋白表达差异存在较高的平行性,在表型上均展示出生物膜形成能力的加强,slyA敲除株生物膜形成...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 根际促生菌与荧光假单胞菌
1.2 MarR蛋白家族简介
1.3 marORAB操纵子的结构
1.4 MarR家族蛋白的的结构
1.5 MarR家族蛋白的功能
1.5.1 抵抗环境压力
1.5.2 抗生素应答
1.5.3 金属离子应答
1.5.4 调节细菌毒力的表达
1.6 MarR家族的SlyA蛋白
1.6.1 SlyA蛋白的功能
1.6.2 SlyA蛋白的结构与DNA结合动力学。
1.6.3 SlyA蛋白与PhoQ-PhoP双组分系统的关联
1.6.4 SlyA既有转录抑制作用,又有转录激活作用
1.7 本文立意
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 试剂与仪器
2.2 实验方法
2.2.1 基因缺失菌株的构建
2.2.2 SlyA蛋白表达载体构建
2.2.3 SlyA蛋白质的表达
2.2.4 SlyA蛋白质的纯化
2.2.5 凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)
2.2.6 DNase I足迹法实验
2.2.7 细菌全RNA的提取、c DNA的制备和荧光定量PCR实验
2.2.8 β-半乳糖苷酶报告载体的构建及β-半乳糖苷酶酶活的测定
2.2.9 菌体总蛋白质组学制样、上样及蛋白质组学分析
2.2.10 细菌的抗生素最小抑制浓度(MIC)检测
2.2.11 细菌运动能力的检测
2.2.12 细菌生物膜形成能力的检测
第三章 实验结果与分析
3.1 转录因子SlyA与转录因子EmhR存在共适应性
3.1.1 共适应性分析
3.1.2 荧光假单胞菌2P24中序列分析
3.2 荧光假单胞菌2P24菌株slyA基因的编码框内敲除
3.3 荧光假单胞菌2P24 菌株SlyA蛋白涉嫌调控emhABC基因
3.3.1 荧光假单胞菌2P24中slyA基因的敲除株负面影响该菌的多重耐药性
3.3.2 SlyA蛋白对emhABC基因的表达调控的探究
3.4 SlyA蛋白识别的DNA序列通式为TTA-N6-TAA
3.4.1 DNase I足迹法寻找SlyA蛋白与DNA链结合的位置
3.4.2 凝胶阻滞实验(EMSA)证明SlyA蛋白的结合序列为TTA-N6-TAA
3.5 荧光假单胞菌2P24与大肠杆菌、鼠沙门氏菌SlyA蛋白序列有一定同源性
3.6 SlyA蛋白自我调控slyA基因的表达
3.7 被SlyA蛋白调控的下游基因的寻找
3.8 SlyA蛋白与双组分系统PhoQ-PhoP功能关系的质谱分析
3.9 slyA基因敲除株与phoP基因敲除株的生物膜、泳动性检测
3.9.1 slyA敲除株与phoP敲除株生物膜形成能力的检测
3.9.2 slyA敲除株与phoP敲除株游泳能力、涌动能力检测
3.10 SlyA蛋白识别小分子配体寻找的尝试
第四章 结论、讨论与展望
4.1 主要结论
4.2 讨论与展望
参考文献
附录
引物汇总
致谢
本文编号：4014407
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 根际促生菌与荧光假单胞菌
1.2 MarR蛋白家族简介
1.3 marORAB操纵子的结构
1.4 MarR家族蛋白的的结构
1.5 MarR家族蛋白的功能
1.5.1 抵抗环境压力
1.5.2 抗生素应答
1.5.3 金属离子应答
1.5.4 调节细菌毒力的表达
1.6 MarR家族的SlyA蛋白
1.6.1 SlyA蛋白的功能
1.6.2 SlyA蛋白的结构与DNA结合动力学。
1.6.3 SlyA蛋白与PhoQ-PhoP双组分系统的关联
1.6.4 SlyA既有转录抑制作用,又有转录激活作用
1.7 本文立意
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 试剂与仪器
2.2 实验方法
2.2.1 基因缺失菌株的构建
2.2.2 SlyA蛋白表达载体构建
2.2.3 SlyA蛋白质的表达
2.2.4 SlyA蛋白质的纯化
2.2.5 凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)
2.2.6 DNase I足迹法实验
2.2.7 细菌全RNA的提取、c DNA的制备和荧光定量PCR实验
2.2.8 β-半乳糖苷酶报告载体的构建及β-半乳糖苷酶酶活的测定
2.2.9 菌体总蛋白质组学制样、上样及蛋白质组学分析
2.2.10 细菌的抗生素最小抑制浓度(MIC)检测
2.2.11 细菌运动能力的检测
2.2.12 细菌生物膜形成能力的检测
第三章 实验结果与分析
3.1 转录因子SlyA与转录因子EmhR存在共适应性
3.1.1 共适应性分析
3.1.2 荧光假单胞菌2P24中序列分析
3.2 荧光假单胞菌2P24菌株slyA基因的编码框内敲除
3.3 荧光假单胞菌2P24 菌株SlyA蛋白涉嫌调控emhABC基因
3.3.1 荧光假单胞菌2P24中slyA基因的敲除株负面影响该菌的多重耐药性
3.3.2 SlyA蛋白对emhABC基因的表达调控的探究
3.4 SlyA蛋白识别的DNA序列通式为TTA-N6-TAA
3.4.1 DNase I足迹法寻找SlyA蛋白与DNA链结合的位置
3.4.2 凝胶阻滞实验(EMSA)证明SlyA蛋白的结合序列为TTA-N6-TAA
3.5 荧光假单胞菌2P24与大肠杆菌、鼠沙门氏菌SlyA蛋白序列有一定同源性
3.6 SlyA蛋白自我调控slyA基因的表达
3.7 被SlyA蛋白调控的下游基因的寻找
3.8 SlyA蛋白与双组分系统PhoQ-PhoP功能关系的质谱分析
3.9 slyA基因敲除株与phoP基因敲除株的生物膜、泳动性检测
3.9.1 slyA敲除株与phoP敲除株生物膜形成能力的检测
3.9.2 slyA敲除株与phoP敲除株游泳能力、涌动能力检测
3.10 SlyA蛋白识别小分子配体寻找的尝试
第四章 结论、讨论与展望
4.1 主要结论
4.2 讨论与展望
参考文献
附录
引物汇总
致谢
本文编号：4014407
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