长白山自然保护区土壤真菌弯颈霉属真菌遗传多样性及分布规律研究

发布时间：2017-06-21 10:05

  本文关键词：长白山自然保护区土壤真菌弯颈霉属真菌遗传多样性及分布规律研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：长白山自然保护区是亚欧大陆保存较完整的生态系统,是研究物种多样性的理想之地。2013年和2014年6、7、8和9月赴长白山自然保护区北坡,依据不同森林类型和土壤类型采用“之”字形多点采样法,在海拔800-2650m区域内采集土壤样品324份。以稀释平板法和形态学鉴定法,共分离得到133株弯颈霉。通过对弯颈霉属(Tolypocladium)真菌在长白山的生态分布分析,发现其种类与数量的分布特点:从海拔1500-1800m逐渐增加,从1800-2000m逐渐减少,从2000-2600m逐渐增加,在2600m以上没有分离到;从6月至8月份离到的弯颈霉的数量逐渐下降,9月又有所回升,但是较7月份少。对133株弯颈霉进行了分子生物学鉴定及18S rDNA-ITS和延长因子(elongation factor 1-α)的核酸序列对比分析。结果表明,利用18S rDNA-ITS序列所建的系统发育树与Blast结果并不一致;与18S rDNA-ITS序列分析相比,依据延长因子核酸序列所建的系统发育树,其鉴定结果更准确。利用ISSR分子标记技术,对133株弯颈霉属真菌进行了遗传多样性分析。从40个通用引物中筛选出了10个稳定性及多态性好的引物,鉴定结果表明,ISSR表现出很高的遗传多态性,多态性条带达到79%,且扩增结果有很好的重复性;无论是海拔还是月份各居群间群体遗传变异较小,这可能是由于弯颈霉生态适应强,即海拔和采集时间(月份)对弯颈霉的遗传变异并没有明显的影响。通过对三种弯颈霉(雪白弯颈霉、柱孢弯颈霉、地生弯颈霉)的生长培养基、pH、光照、氮源和碳源等生物学特性的研究发现,在同一环境下,最适光照条件为光暗交替(12h),最适合培养基为PDA,孢子萌发的最适碳源为葡萄糖,最适氮源为硫酸铵;三者不同的是:三种弯颈霉中,雪白弯颈霉(Tolypocladium niveum)的长势始终最好,产孢量也总体偏高。雪白弯颈霉的最适培养基为PDA,最适温度为25?C,对酸度不敏感,当pH为7时,产孢量最大。其菌落生长最适合碳源为葡萄糖,最适氮源为硝酸钠;地生弯颈霉的最适培养基为MEA,最适温度为30?C,最适pH值为6。其菌落生长最适碳源为葡萄糖,最适氮源为柠檬酸铵;柱孢弯颈霉的最适培养基为PDA,最适温度为25℃,柱孢弯颈霉的生长对酸度不是特别明显。最适碳源为葡萄糖,最适氮源为硝酸钠。
【关键词】：长白山 弯颈霉 18S rDNA-ITS 延长因子 ISSR 生物学特性
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 综述11-20
• 1.1 长白山自然保护区概述11-12
• 1.2 土壤真菌多样性研究概述12-13
• 1.3 弯颈霉属真菌的研究进展13-16
• 1.4 环孢菌素16-17
• 1.5 rDNA-ITS序列分析和延长因子序列分析17-18
• 1.6 ISSR分子标记技术18-20
• 2 长白山弯颈霉属真菌形态学多样性以及其分布特点20-23
• 2.1 材料与方法20-21
• 2.1.1 土壤采集方法20
• 2.1.2 试验方法20
• 2.1.3 培养基20-21
• 2.2 长白山弯颈霉属真菌的生态分布特点21-23
• 2.2.1 不同海拔长白山弯颈霉属真菌分布的特点21-22
• 2.2.2 不同月份长白山弯颈霉属真菌分布特点22-23
• 3 长白山弯颈霉属真菌的分子生物学鉴定23-30
• 3.1 材料方法23-24
• 3.1.1 菌株来源23
• 3.1.2 试验仪器23-24
• 3.1.3 试剂24
• 3.2 研究方法24-25
• 3.2.1 基因组DNA的提取24
• 3.2.2 DNA的检测24-25
• 3.3 rDNA-ITS序列分析25-27
• 3.3.1 rDNA-ITS序列扩增25
• 3.3.2 rDNA-ITS序列分析结果25-27
• 3.4 长白山弯颈霉属真菌延长因子序列分析27-29
• 3.4.1 弯颈霉属真菌延长因子序列扩增27
• 3.4.2 延长因子序列分析结果27-29
• 3.5 长白山弯颈霉属真菌不同基因序列分析的比较29-30
• 4 长白山弯颈霉属真菌的ISSR分子标记技术研究30-41
• 4.1 材料与方法30-34
• 4.1.1 菌株及其来源30-31
• 4.1.2 DNA的提取31
• 4.1.3 ISSR引物的筛选31-32
• 4.1.4 ISSR温度梯度PCR32-33
• 4.1.5 ISSR反应体系优化33-34
• 4.2 结果与分析34-41
• 4.2.1 ISSR扩增的正交优化34-35
• 4.2.2 ISSR引物筛选结果35-36
• 4.2.3 ISSR-PCR扩增结果检测以及数据分析36
• 4.2.4 ISSR-PCR扩增结果36
• 4.2.5 长白山弯颈霉属真菌群体遗传多样性36-37
• 4.2.6 长白山弯颈霉属真菌聚类分析与讨论37-41
• 5 长白山弯颈霉属真菌生物学特性的研究41-51
• 5.1 材料与方法41
• 5.1.1 试验菌株41
• 5.1.2 实验用培养基及配方41
• 5.2 试验方法41-43
• 5.2.1 分离活化弯颈霉菌株41-42
• 5.2.2 培养基对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响42
• 5.2.3 碳源对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响42
• 5.2.4 氮源的对三种弯颈霉属真菌菌落大小、产孢的影响42
• 5.2.5 光照强度对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响42
• 5.2.6 酸碱度对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响42-43
• 5.2.7 温度对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响43
• 5.3 结果与分析43-51
• 5.3.1 培养基对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响43-44
• 5.3.2 碳源对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响44-45
• 5.3.3 氮源对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响45-47
• 5.3.4 光照对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响47-48
• 5.3.5 温度对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响48-49
• 5.3.6 酸碱度对三种弯颈霉属真菌菌落生长、产孢的影响49-51
• 结论51-53
• 参考文献53-57
• 附录A 弯颈霉延长因子序列57-109
• 附录B 弯颈霉的ISSR种群遗传相似性系数GS109-110
• 附录C 弯颈霉在不同培养条件下的产孢量(108个/mL)110-113
• 附录D 三种弯颈霉在不同培养基培养 7d的菌落图113-115
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况115-116
• 致谢116

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