类球红细菌遗传操作体系的构建及其产辅酶Q10代谢工程研究

发布时间：2017-07-29 12:04

  本文关键词：类球红细菌遗传操作体系的构建及其产辅酶Q10代谢工程研究

  更多相关文章： 类球细菌 辅酶Q10 接合转移 pBBR1MCS-2 启动子 温敏质粒 定向进化 ddsa GFP

【摘要】：辅酶Q10(CoQ10)是细胞有氧呼吸链电子传递链中重要的辅因子,由苯醌环母核和聚十疏水类异戊二烯链组成。辅酶Q 1 0通过抗氧化和清除自由基等特性保护机体器官和组织。广泛应用于食品营养添加、心血管疾病的治疗和化妆品添加。由于辅酶Q10的大量需求,吸引了国内外众多的公司对其进行商业开发。生产辅酶Q10的方法多种多样,微生物发酵法是当前最具前景的方法,但通过对微生物传统的育种和发酵条件优化己处瓶颈期。要实现工业化生产,对菌株进行改造,获得高产辅酶Q10菌株是首要解决的问题。本实验以高产辅酶Q10菌株之一类球红细菌为研究对象,从改造其遗传操作体系入手,再通过代谢工程和定向进化的方式对类球红细菌进行改造,提高菌株产辅酶Q10能力。本研究的主要内容分为以下几部分：1、试图对类球红细菌进行改造,首先,要构建以类球红细菌为底盘细胞的遗传操作体系。本实验通过将宽宿主质粒pBBR1MCS-2和重组质粒pBBR1MCS2-RFP接合进入类球红细菌,对供体菌大肠杆菌S17.1和受体菌类球红细菌的菌浓进行配比实验,确立了类球红细菌的接合转移操作过程中供体菌和受体菌以0.20D：1.20D的菌浓配比,接合效果好。通过比较供体大肠杆菌S17.1和类球红细菌对K2TeO3和萘啶酮酸的耐受性差异,确定了接合子的筛选方法。综上,获得了高效准确的宽宿主质粒pBBR1MCS-2接合转移类球红细菌方法。2、对质粒pBBR1MCS-2进行改造,分别串联6个外源启动子和EGFP(绿色荧光蛋白),构建了重组载体pBBR1MCS2-tacGFP、pBBR1MCS2-119GFP、 pBBR1MCS2-badGFP、pBBR1MCS2-cpa3GFP、pBBR1MCS2-cpa1GFP pBBR1MCS2-wpa1GFP。将重组载体分别接合转移进入类球红细菌,通过荧光分光光度计和流式细胞仪检测GFP的荧光强度,间接比较了各启动子的强度依次是tac119badcpa3cpa1wpa1。3、将辅酶Q10合成途径中重要的限速酶基因ddsa替换EGFP基因串联在相对强的启动子后,构建了载体pBBR1MCS2-tac-ddsa、pBBR1MCS2-cpa3-ddsa、 pBBR1MCS2-119-ddsa。还在质粒pBBR1MCS2中启动Kan表达的启动子后加上ddsa基因,构建了载体Gbbr1-ddsa。将四个重组质粒结合转移进入类球红细菌,通过HPLC检测,其中转入质粒Gbbr1-ddsa的类球红细菌Q10的表达量达到220.6 mg/L,较出发菌株产量提高了15.7%。4、以杜邦专利为参考,对宽宿主质粒pBBR1MCS-2的rep基因进行随机突变,通过重复筛选验证,获得温度敏感质粒MpBBR1MCS-2#31。5、定向进化能使基因快速突变,人为加入适当的筛选剂,可以定向选择出人们所期望得到的具有特定性质的菌株。本研究首先对类球红细菌进行UV(紫外线)和ARTP(常温低压等离子技术)处理后,加入辅酶Q10结构类似物三氟丙酮酸及呼吸抑制剂膦胺霉素、鱼藤酮共筛选获得较出发菌株产量提高了10.3%、12.5%的突变菌株。
【关键词】：类球细菌 辅酶Q10 接合转移 pBBR1MCS-2 启动子 温敏质粒 定向进化 ddsa GFP
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-6
• 中文文摘6-11
• 绪论11-21
• 第一节 辅酶Q10简介11-13
• 第二节 辅酶Q10的生产方法及研究状况13-14
• 第三节 辅酶Q10的高产菌株育种14-16
• 第四节 类球红细菌16-18
• 第五节 论文的选题依据和意义18-19
• 第六节 本研究的主要内容19-21
• 第一章 类球红细菌接合转移方法的研究21-35
• 第一节 材料与方法21-30
• 第二节 结果与分析30-33
• 第三节 小结与讨论33-35
• 第二章 强启动子的筛选35-45
• 第一节 材料与方法35-38
• 第二节 结果与分析38-42
• 第三节 小结与讨论42-45
• 第三章 不同启动子过表达ddsa45-55
• 第一节 材料与方法45-49
• 第二节 结果与分析49-54
• 第三节 小结与讨论54-55
• 第四章 温度敏感性质粒筛选55-65
• 第一节 材料与方法55-59
• 第二节 结果与分析59-62
• 第三节 小结与讨论62-65
• 第五章 定向进化代谢工程改造RS65-73
• 第一节 材料与方法65-69
• 第二节 结果与分析69-71
• 第三节 小结与讨论71-73
• 第六章 结论与展望73-75
• 参考文献75-83
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果83-85
• 致谢85-87
• 个人简历87-90

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本文编号：589040