华山新麦草三个SnRK2基因的克隆及表达分析

发布时间：2017-07-30 23:23

  本文关键词：华山新麦草三个SnRK2基因的克隆及表达分析

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【摘要】：植物在长期进化过程中受到包括干旱、盐渍、重金属毒害等在内的多种非生物胁迫,严重限制作物生物产量及生物质产量的提升。多种蛋白激酶及蛋白磷酸酶参与到植物对压力信号的识别和转导中,其中蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族成员SnRK2在植物生长和新陈代谢相关的逆境信号应答调控方面发挥重要作用。尽管目前已有关于SnRK2在拟南芥、水稻、玉米、小麦等多个物种的相关研究,然而对其在逆境应答响应中作用的分子机制及功能表达涉及较少,且尚无SnRK2在小麦近缘野生属物种—华山新麦草上的相关报道。华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng ex P. C. Kuo)是仅生长于我国陕西华山的一类禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)新麦草属(Psathyrostachys Nevski)多年生草本植物,具有早熟、优质、抗病、抗旱、耐盐碱等多项优良特性。本研究根据矮秆波兰小麦相关转录组数据,设计8对特异性引物来克隆华山新麦草中SnRK2基因全长cDNA序列,得到其中的3个,即PhSnRK2.5、PhSnRK2.8和PhSnRK2.11。通过生物信息学分析及逆境胁迫处理条件下的表达模式分析,揭示华山新麦草中3个SnRK2基因家族成员的表达特性。研究结果如下：1.华山新麦草PhSnRK2.5全长cDNA序列为1252 bp,包含870 bp的开放阅读框、148 bp的5’-UTR和234 bp的3’-UTR。与矮秆波兰小麦同源序列TpSnRK2.5相似,PhSnRK2.5提前出现终止密码子仅编码了290个氨基酸。PhSnRK2.5与小麦、玉米、水稻和拟南芥同源基因的相似度分别为99.6%、92.5%、91.4%和82.0%。该蛋白激酶具有高保守N端结构域和不完整的C端,包含一个ATP结合位点、一个N端豆蔻酰胺化位点、一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶激活位点、一个潜在的跨膜域和一个激活环。2. PhSnRK2.8全长cDNA序列为1473 bp,包含1251 bp的开放阅读框、44 bp的5’-UTR和44 bp的3’-UTR,编码367个氨基酸。与小麦、玉米和水稻相关同源基因的相似度分别为90.4%、94.8%和96.4%。PhSnRK2.8具有高保守N端催化域和酸性C端调控域,存在一个ATP结合位点、一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶激活位点及一些典型SnRK2基序特征结构如N端豆蔻酰胺化位点、跨膜结构域、激活环等。3. PhSnRK2.11全长cDNA序列具有1164 bp,包括1080 bp的开放阅读框和84 bp的3’-UTR,编码360个氨基酸,与玉米ZmSnRK2.11的相似度仅为83.1%。N端结构域存在一个ATP结合位点、一个N端豆蔻酰胺化位点、一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶激活位点、一个潜在跨膜结构域和一个激活环。4.PhSnRK2.5和PhSnRK2.11均属于第一亚族,不受ABA激活；而PhSnRK2.8归属于第三亚族,为ABA依赖蛋白激酶类群。5.表达定量分析结果表明PhSnRK2.8和PhSnRK2.11能够响应ABA、重金属、高盐和高渗的胁迫诱导并且不同处理条件下的表达模式存在明显差异。根据表达峰值出现时间的先后,PhSnRK2.8对这四种胁迫诱导处理的敏感程度为：重金属高盐ABA高渗,而PhSnRK2.11的表达敏感程度：高渗高盐ABA重金属。
【关键词】：华山新麦草 SnRK2 重金属 渗透胁迫 表达定量
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-10
• 1 文献综述10-18
• 1.1 非生物胁迫及危害10-12
• 1.2 植物响应非生物胁迫的分子应答机制12-13
• 1.3 植物SnRK2蛋白激酶13-16
• 1.3.1 SnRK1和SnRK3亚家族14
• 1.3.2 S RK2研究进展14-16
• 1.4 本研究的目的意义和内容16-18
• 1.4.1 目的意义17
• 1.4.2 研究内容及技术路线17-18
• 2 材料与方法18-22
• 2.1 实验材料18
• 2.1.1 植物材料18
• 2.1.2 酶及其他耗材18
• 2.2 实验方法18-22
• 2.2.1 植物培养及胁迫处理18-19
• 2.2.2 华山新麦草总RNA提取19-20
• 2.2.3 cDNA合成20
• 2.2.4 目的基因全长cDNA克隆20-21
• 2.2.5 生物信息学分析21
• 2.2.6 荧光定量PCR21-22
• 3 结果与分析22-31
• 3.1 华山新麦草三个SnRK2基因22-27
• 3.1.1 PhSnRK2.523
• 3.1.2 PhSnRK2.823-24
• 3.1.3 PhSnRK2.1124
• 3.1.4 C 端保守motifs24-27
• 3.2 系统关系分析27-28
• 3.3 不同非生物胁迫下的基因表达定量28-31
• 4 讨论31-34
• 4.1 华山新麦草SnRK2s具有SnRK2基因家族的典型特征31-33
• 4.2 不同逆境胁迫条件下基因的表达不同33-34
• 5 结论34-35
• 参考文献35-45
• 致谢45-47
• 在读期间发表学位论文47

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