辽宁碱蓬SINAC6、SINAC7基因克隆及功能分析

发布时间：2017-08-11 10:14

  本文关键词：辽宁碱蓬SINAC6、SINAC7基因克隆及功能分析

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【摘要】：NAC转录因子在植物的生长发育,抵抗干旱、高盐、低温、损伤、病毒,以及其它生理过程中起着重要的调控作用。辽宁碱蓬是一种盐生植物,有大量的耐盐基因待研究。本论文以实验室前期获得的辽宁碱蓬的两个NAC转录因子(命名为SlNAC6、SlNAC7)的EST序列为对象,进行了基因克隆和功能研究。RACE技术获得了SlNAC6、SlNAC7 cDNA全长序列,SlNAC6 cDNA 1301 bp,GenBank登录号为KR002106,编码353个氨基酸,GenBank登录号为KR002106;SlNAC7cDNA 1863bp,编码573个氨基酸,GenBank登录号为KR002107。多重序列比对及进化树分析表明,SlNAC6属于ONAC003亚家族,SlNAC7属于ANAC011亚家族。实时定量PCR技术分析两个转录因子基因的表达特性。SlNAC6与SlNAC7在辽宁碱蓬的根、茎、叶中均有表达,叶中表达量较高。SlNAC6、SlNAC7响应盐、低温、干旱和ABA胁迫。酵母单杂交分析结果显示,SlNAC6、SlNAC7及SlNAC6的C端、SlNAC7的C端均具有转录激活活性,而保守的N端均不具有转录激活活性。推测SlNAC6、SlNAC7是转录因子,转录激活域在C端。基因枪转化法分别将SlNAC6-GFP、SlNAC7-GFP融合蛋白转化至洋葱表皮细胞,结果显示,SlNAC6-GFP、SlNAC7-GFP融合蛋白分布于细胞核、细胞质中,推测分布于细胞核中的SlNAC6、SlNAC7是转录因子,在核内行使转录因子的功能,分布于细胞质中的SlNAC6、SlNAC7可能具有其他功能。蘸花法分别将SlNAC6与SlNAC7转化拟南芥,获得纯合的转基因拟南芥。对转基因拟南芥进行非生物胁迫处理,结果显示,SlNAC6与SlNAC7提高了转基因拟南芥对于盐、低温和干旱的耐受性。对辽宁碱蓬非生物胁迫相关NAC转录因子的研究,不仅有助于理解植物抗逆机制,而且也将为抗逆作物培育奠定基础。
【关键词】：辽宁碱蓬 NAC转录因子 转基因拟南芥 非生物胁迫
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 1 文献综述11-19
• 1.1 胁迫相关的植物转录因子11-13
• 1.1.1 MYB转录因子11-12
• 1.1.2 WRKY转录因子12-13
• 1.1.3 AP2/EREBP转录因子13
• 1.2 NAC转录因子13-17
• 1.2.1 NAC转录因子的结构与分类14-15
• 1.2.2 NAC转录因子的功能15-16
• 1.2.3 NAC转录因子的调控机制16-17
• 1.3 辽宁碱蓬17
• 1.4 本研究的目的及意义17-18
• 1.5 研究技术路线18-19
• 2 辽宁碱蓬SlNAC6、SlNAC7基因克隆及序列分析19-34
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 材料19
• 2.1.2 试剂及耗材19
• 2.1.3 引物及测序19
• 2.1.4 仪器设备19-20
• 2.2 实验方法20-25
• 2.2.1 辽宁碱蓬叶片总RNA的提取和检测20
• 2.2.2 SlNAC6、SlNAC7 EST序列验证20-25
• 2.2.3 辽宁碱蓬SlNAC6、SlNAC7基因序列分析25
• 2.3 实验结果25-33
• 2.3.1 辽宁碱蓬总RNA的提取25-26
• 2.3.2 SlNAC6、SlNAC7 EST序列验证26-28
• 2.3.3 SlNAC6、SlNAC7基因序列分析28-33
• 2.4 讨论33-34
• 3 辽宁碱蓬SlNAC6、SlNAC7基因表达特性分析34-42
• 3.1 实验材料34-35
• 3.1.1 材料34
• 3.1.2 试剂及耗材34
• 3.1.3 引物及测序34
• 3.1.4 仪器设备34-35
• 3.2 实验方法35-37
• 3.2.1 辽宁碱蓬幼苗的栽培35
• 3.2.2 辽宁碱蓬的非生物胁迫处理35-36
• 3.2.3 SlNAC6、SlNAC7基因表达特性分析36-37
• 3.3 实验结果37-41
• 3.3.1 辽宁碱蓬总RNA提取37-38
• 3.3.2 辽宁碱蓬SlNAC6、SlNAC7表达特性38-41
• 3.5 讨论41-42
• 4 辽宁碱蓬SlNAC6、SlNAC7转录激活作用分析42-52
• 4.1 实验材料42-43
• 4.1.1 菌株及载体42
• 4.1.2 酶及化学试剂42
• 4.1.3 引物及测序42
• 4.1.4 仪器设备42-43
• 4.2 实验方法43-48
• 4.2.1 克隆载体的构建43-45
• 4.2.2 表达载体的构建45-48
• 4.2.3 转录激活作用分析48
• 4.3 实验结果48-51
• 4.3.1 酵母表达载体的构建48-50
• 4.3.2 转录激活作用50-51
• 4.4 讨论51-52
• 5 辽宁碱蓬SlNAC6、SlNAC7亚细胞定位分析52-59
• 5.1 实验材料52-53
• 5.1.1 材料、菌株及载体52
• 5.1.2 酶及化学试剂52
• 5.1.3 培养基52
• 5.1.4 引物及测序52
• 5.1.5 仪器设备52-53
• 5.2 实验方法53-57
• 5.2.1 克隆载体的构建53
• 5.2.2 表达载体的构建53-55
• 5.2.3 基因枪法转化洋葱表皮细胞55-57
• 5.3 实验结果57-58
• 5.3.1 亚细胞定位的载体构建57-58
• 5.3.2 亚细胞定位58
• 5.4 讨论58-59
• 6 SlNAC6、SlNAC7转化拟南芥及转基因拟南芥抗逆性分析59-74
• 6.1 实验材料59-60
• 6.1.1 材料、菌株及载体59
• 6.1.2 酶及化学试剂59
• 6.1.3 培养基59
• 6.1.4 引物及测序59
• 6.1.5 仪器设备59-60
• 6.2 实验方法60-67
• 6.2.1 克隆载体的构建60
• 6.2.2 表达载体的构建60-62
• 6.2.3 农杆菌转化法62-63
• 6.2.4 拟南芥的种植63-64
• 6.2.5 蘸花法转化拟南芥64
• 6.2.6 转基因植株的筛选64-65
• 6.2.7 转基因植株的鉴定-半定量PCR65-66
• 6.2.8 转基因植株的抗性分析66-67
• 6.3 实验结果67-73
• 6.3.1 植物表达载体的构建67-68
• 6.3.2 转基因拟南芥的筛选68-69
• 6.3.3 转基因植株的鉴定-半定量PCR69-70
• 6.3.4 转基因拟南芥的抗性分析70-73
• 6.4 讨论73-74
• 结论74-75
• 参考 文献75-79
• 附录A 培养基的配置79-82
• 附录B DNA Marker82-83
• 附录C λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker83-84
• 附录D pGBKT7载体图谱84-85
• 附录E pEGAD载体图谱85-86
• 附录F pBI121载体图谱86-87
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况87-88
• 致谢88

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本文编号：655540