泡萝卜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克

发布时间：2017-08-21 22:19

  本文关键词：泡萝卜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

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【摘要】：本文利用实验室前期从萝卜泡菜中筛选出一株具有降解亚硝酸盐能力的植物乳杆菌为研究材料,根据GenBank中亚硝酸盐还原酶(nir)基因序列,利用生物信息学软件设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增亚硝酸盐还原酶(nir)基因,TA克隆获得重组质粒pMD19-nir,分析亚硝酸盐还原酶核苷酸序列的同源性。通过双酶切连接到表达载体pET-32a(+)中,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nir,然后转化至E.coli BL(DE3)。由于目的蛋白形成了包涵体,对其进行纯化,然后进行酶学性质的初步分析,主要结论如下：(1)根据GenBank中Lactobacillus plantarum WCFS1全部基因序列,设计特异性引物。采用PCR技术扩增亚硝酸盐还原酶(nir)基因,通过TA克隆获得重组质粒pMD19-nir。对重组质粒进行测序,然后用软件分析测序结果：亚硝酸盐还原酶(nir)基因开放阅读框(ORF)碱基的长度为1638bp,序列经NCBI Blast比对,与其它nir(JX434610-1)的最高同源性为99%。即成功克隆出亚硝酸盐还原酶的基因。(2)双酶切T克隆质粒和表达载体pET-32a(+),然后进行连接反应,获得重组表达载体pET-32a(+)-nir,将构建成功的表达载体转化到E.coli BL(DE3)中。重组表达菌株提取质粒DNA后,经PCR鉴定和双酶切鉴定正确后。将重组表达菌株在IPTG诱导下,收集菌体,然后用预冷的PBS缓冲液洗涤,超声波破碎后,取沉淀和上清液进行SDS-PAGE电泳检测。分析结果：重组蛋白存在于沉淀中,即形成的包涵体,其分子量大小为80kDa,即成功构建了大肠杆菌的表达菌株并且经诱导表达能产生目的蛋白。(3)由于重组目的蛋白形成了包涵体,需用8mol/L高浓度的尿素溶解包涵体,利用带有6个his标签,进行Ni2+柱亲和层析纯化,当pH降到4.3,从Ni2＋柱中洗脱出目的蛋白,将目的蛋白溶液分别在4mol/L、2mol/L、0mol/L进行尿素的梯度透析复性,然后将蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。对复性后的重组酶进行酶学性质分析,在不同pH值和温度下测定亚硝酸盐还原酶(nir)的酶活力。对结果进行分析：纯化后蛋白中其杂蛋白明显减少,从而提高了目的蛋白的含量。在不同温度下酶活力的检测,在20-35℃条件下,随着温度的增加,酶活力逐渐增加,在35℃达到最大值为72.39U/mL,然后随着温度的增加酶活力逐渐降低。在pH值5.5-8.0条件下,酶活力随着pH值的增加呈现为先增加后降低,在pH值为7.5时达到最大值,即在35℃,pH值为7.5时,测定重组酶的酶活最大值为101.99U/mL。酶动力学参数中Km为59.17mmol/L, Vm为166.67nmol/min·μL。即构建的重组表达菌株经诱导表达产生的包涵体经纯化后,具有一定的酶活力。
【关键词】：植物乳杆菌 亚硝酸盐还原酶 克隆 基因表达 酶学性质
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩写词说明8-11
• 1 前言11-19
• 1.1 文献综述11-16
• 1.1.1 四川泡菜概述11-12
• 1.1.2 亚硝酸盐的来源12
• 1.1.3 亚硝酸盐的危害12-13
• 1.1.4 硝酸盐降解方法的研究13-15
• 1.1.5 硝酸盐还原酶的研究进展15-16
• 1.2 研究目的和意义16-17
• 1.3 研究内容与技术路线17-19
• 1.3.1 实验的研究内容17-18
• 1.3.2 实验技术路线18-19
• 2 材料与方法19-34
• 2.1 试验材料19-21
• 2.1.1 供试菌种及克隆载体19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 主要仪器19-20
• 2.1.4 试剂和培养基的配制20-21
• 2.2 实验方法21-34
• 2.2.1 亚硝酸盐还原酶基因的克隆21-27
• 2.2.2 亚硝酸盐还原酶基因的原核表达27-29
• 2.2.3 重组酶的纯化29-31
• 2.2.4 重组酶的酶学性质研究31-34
• 3 结果与分析34-44
• 3.1 亚硝酸盐还原酶(nir)基因的克隆34-37
• 3.1.1 亚硝酸盐还原酶(nir)基因的扩增34
• 3.1.2 T克隆的PCR鉴定34-35
• 3.1.3 T克隆的双酶切鉴定及序列比对结果35-37
• 3.2 亚硝酸盐还原酶(nir)基因的表达37-40
• 3.2.1 重组质粒pET-32a(+)-nir的PCR鉴定37-38
• 3.2.2 重组质粒pET-32a-nir的双酶切鉴定38-39
• 3.2.3 亚硝酸盐还原酶在大肠杆菌中的表达39-40
• 3.3 重组酶的纯化40-41
• 3.3.1 重组酶纯化后的电泳检测40-41
• 3.4 重组酶的酶学性质分析结果41-44
• 3.4.1 亚硝酸钠的标准曲线41-42
• 3.4.2 不同温度对重组酶酶活的影响42
• 3.4.3 不同pH值对重组酶酶活的影响42-43
• 3.4.4 Km值的测定43-44
• 4 讨论44-47
• 4.1 亚硝酸盐还原酶基因的克隆和表达44
• 4.2 包涵体的纯化44-45
• 4.3 酶学性质的分析45-46
• 4.4 酶活力的分析46-47
• 5 结论与展望47-49
• 5.1 结论47
• 5.2 展望47-49
• 参考文献49-55
• 致谢55-56
• 攻读硕士期间发表的学术论文56-57
• 附录57-58

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本文编号：715444