一株耐酒精纤维素酶产生菌的选育及纤维素内切酶组份研究

发布时间：2017-09-11 04:15

  本文关键词：一株耐酒精纤维素酶产生菌的选育及纤维素内切酶组份研究

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【摘要】：本文利用乙醇-CMC-Na平板进行初筛,从不同材料中筛选产耐酒精纤维素酶的菌株。经过摇瓶发酵复筛,对产酶较高的菌株进行形态观察、生理生化测定及16S rDNA基因序列的同源性分析,获得一株产酶稳定的枯草芽孢杆菌Lys-1249。经产酶条件的正交优化,菌株及其所产的纤维素酶耐受酒精程度分析,菌株纤维素酶酶系的组成分析,并将该菌株纤维素内切酶组分经胰蛋白酶酶切,其片段的一级质谱信息经swissprot数据库鉴定,对与数据库中匹配较好的片段进一步进行二级质谱鉴定；同时对菌株纤维素酶系相关信息与Uniprot蛋白质数据库进行了比较分析。本文得出如下主要结论：1、通过产酶条件优化,表明菌株Lys-1249在麸皮2.0%,蛋白胨0.6%,K2HPO40.1%, MgSO4·7H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.02%, MnSO40.01%,培养基初始pH 7.0,培养温度37℃,发酵周期48h条件下,其耐酒精纤维素酶活力达到158.54U/mL。该菌株在6.0%乙醇培养基中生长良好；该菌株纤维素酶在乙醇6.0%-CMC-Na 1.0%的底物中活性保持65.95%。2、纤维素酶通过活性电泳分离纯化后,将活性胶平铺CMC-Na平板,可以通过检测水解底物透明条带,从而建立一种鉴别该纤维素酶酶系的组分可行方法,该方法具有直观(直接观察水解透明条带),灵敏(可以检测到0.1-0.2μg/mL内切酶蛋白含量)的特点。通过该方法,发现菌株Lys-1249有3个内切酶组分,分别为p1, p2, p3, 三者均只有一种亚基,其中p1的分子量为65.1Ku, p2的分子量为43.7Ku,p3的分子量为48.0Ku。菌株Lys-1249内切酶组分p1, p2, p3经胰蛋白酶酶切,其片段的一级质谱、二级质谱信息经swissprot数据库鉴定分析,同时在Uniprot蛋白质数据库进行了比较,发现菌株Lys-1249内切酶组分p 1, p2与Bacillus subtilis (strain 168) Glucose-6-phosphate isomerase匹配性好,采用打分法分析相似度具有显著性。未发现与Lys-1249内切酶组分p3匹配性好菌株相关蛋白信息。
【关键词】：纤维素内切酶 筛选 发酵 酒精 芽孢杆菌
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-22
• 1.1 纤维素概述11-12
• 1.1.1 纤维素简介11
• 1.1.2 纤维素的应用11-12
• 1.2 纤维素酶概述12-16
• 1.2.1 纤维素酶分类12-13
• 1.2.2 纤维素酶的来源13-14
• 1.2.3 纤维素酶应用14-16
• 1.2.4 纤维素酶与生物能源16
• 1.3 酒精生产16-18
• 1.3.1 发酵酒精及其耐酒精微生物研究现状16-17
• 1.3.2 酒精生产工艺17-18
• 1.3.3 燃料酒精18
• 1.4 纤维生物质与燃料乙醇18-19
• 1.5 耐酒精纤维素酶19-20
• 1.6 本实验研究的目的和意义20-21
• 1.7 本实验研究的内容21-22
• 1.7.1 耐酒精纤维素酶产生菌的筛选、鉴定21
• 1.7.2 耐酒精纤维素酶产生菌的产纤维素酶条件研究21
• 1.7.3 耐酒精纤维素酶产生菌的产纤维素内切酶组份研究21-22
• 第二章 耐酒精纤维素酶及其生产菌的筛选、鉴定22-33
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 实验材料的采集22
• 2.1.2 培养基22-23
• 2.1.3 主要试剂23
• 2.1.4 主要仪器23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 产纤维素酶菌株的初筛23-24
• 2.2.2 产纤维素酶菌株的摇瓶发酵复筛24
• 2.2.3 耐酒精纤维素酶活力的测定24-25
• 2.2.4 菌株形态、培养和生理生化鉴定25
• 2.2.5 菌株16S rDNA鉴定及分析25
• 2.2.6 菌株Lys-1249耐酒精性能分析25
• 2.2.7 菌株Lys-1249纤维素酶耐酒精性能分析25
• 2.3 结果与分析25-32
• 2.3.1 葡萄糖标准曲线测定结果25-26
• 2.3.2 耐酒精纤维素酶产生菌筛选结果26-27
• 2.3.3 耐酒精纤维素酶产生菌摇瓶复筛结果27-28
• 2.3.4 菌株Lys-1249形态和生理生化特征28-30
• 2.3.5 菌株Lys-1249 16s RNA测序鉴定30
• 2.3.6 菌株Lys-1249耐酒精性能分析30-31
• 2.3.7 菌株Lys-1249纤维素酶耐酒性能分析31-32
• 2.4 小结32-33
• 2.4.1 耐酒精纤维素酶产生菌平板筛选方法32
• 2.4.2 耐酒精纤维素酶产生菌及其酶耐酒精性能32
• 2.4.3 耐酒精纤维素酶检测方法32-33
• 第三章 耐酒精纤维素酶生产菌的Lys-1249产酶条件的优化33-44
• 3.1 材料33-34
• 3.1.1 菌株Lys-124933
• 3.1.2 基本发酵培养基33
• 3.1.3 主要试剂33-34
• 3.2 方法34-35
• 3.2.1 发酵温度对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34
• 3.2.2 碳源对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34
• 3.2.3 麸皮对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34
• 3.2.4 氮源对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34
• 3.2.5 蛋白胨对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34
• 3.2.6 培养基起始pH值对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34
• 3.2.7 接种量对菌株Lys-1249产纤维素酶影响34-35
• 3.2.8 培养基装液量对菌株Lys-1249产纤维素酶影响35
• 3.2.9 摇床转速对菌株Lys-1249产纤维素酶影响35
• 3.2.10 发酵周期对菌株Lys-1249产纤维素酶影响35
• 3.2.11 正交试验优化菌株Lys-1249产纤维素酶的条件35
• 3.3 结果与分析35-43
• 3.3.1 发酵温度对菌株Lys-1249产纤维素酶影响35-36
• 3.3.2 碳源对菌株Lys-1249产纤维素酶影响36
• 3.3.3 麸皮对菌株Lys-1249产纤维素酶影响36-37
• 3.3.4 氮源对菌株Lys-1249产纤维素酶影响37
• 3.3.5 蛋白胨对菌株Lys-1249产纤维素酶影响37-38
• 3.3.6 培养基起始pH值对菌株Lys-1249产纤维素酶影响38-39
• 3.3.7 接种量对菌株Lys-1249产纤维素酶影响39
• 3.3.8 培养基装液量对菌株Lys-1249产纤维素酶影响39-40
• 3.3.9 摇床转速对菌株Lys-1249产纤维素酶影响40
• 3.3.10 发酵周期对菌株Lys-1249产纤维素酶影响40-41
• 3.3.11 正交试验优化菌株Lys-1249产纤维素酶的条件41-43
• 3.4 小结43-44
• 第四章 枯草芽孢杆菌Lys-1249的耐酒精纤维素内切酶组份研究44-53
• 4.1 材料44
• 4.1.1 菌株Lys-124944
• 4.1.2 主要试剂44
• 4.2 方法44-47
• 4.2.1 纤维素酶发酵培养基及培养条件44-45
• 4.2.2 测定耐酒精纤维素酶活力45
• 4.2.3 菌株Lys-1249纤维素酶的制备45
• 4.2.4 纤维素酶的硫酸铵浓缩45
• 4.2.5 耐酒精纤维素酶系活性电泳及平板催化分析45
• 4.2.6 耐酒精纤维素酶系组分活性电泳纯化45
• 4.2.7 纤维素酶系组分的亚基分子量测定45-46
• 4.2.8 菌株Lys-1249纤维素酶系组份的质谱鉴定分析46-47
• 4.3 结果与分析47-52
• 4.3.1 耐酒精纤维素酶系活性电泳剂平板催化分析47-48
• 4.3.2 耐酒精纤维素酶组分亚基分子量的测定48
• 4.3.3 耐酒精纤维素酶组分二级质谱分析的测定48-52
• 4.4 小结52-53
• 第五章 结论53-55
• 5.1 实验研究性结论53-54
• 5.2 论文研究的不足与下一步研究方向54
• 5.3 创新点54-55
• 参考文献55-61
• 致谢61

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6 杨永彬,黄谚谚,林跃鑫;纤维素酶的结构及分子多样性[J];生命的化学;2004年03期

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3 王菁莎　王颉 刘景彬;纤维素酶的应用现状[N];中国食品质量报;2009年

4 刘国信;开发纤维素酶制剂大有可为[N];经理日报;2004年

5 陆慕寒 整理;35项印染行业节能减排先进技术——助剂篇(二)[N];中国纺织报;2008年

6 山东农业大学 王纪亭;饲料原料资源匮乏出路何在[N];中国畜牧报;2003年

7 ;2009年印染行业节能减排优秀技术创新成果推介[N];中国纺织报;2009年

8 冯卫东;科技将这样改变我们的生活[N];科技日报;2008年

9 ;高活力纤维素酶生产技术　[N];中国化工报;2002年

10 本报记者 李晓岩;生物炼制：突破纤维素利用瓶颈[N];中国化工报;2007年

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