蓝光诱导转录因子NgAUREO1对酿酒酵母细胞大小调控机理及转基因酵母发酵能力的初步研究

发布时间：2017-09-27 01:20

  本文关键词：蓝光诱导转录因子NgAUREO1对酿酒酵母细胞大小调控机理及转基因酵母发酵能力的初步研究

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【摘要】：转录因子是一类能够识别基因启动子区的顺式作用元件并与之特异性地结合,对基因转录有激活或抑制效应的蛋白质分子,从分子水平上调控生物体的多种生理活动。目前对转录因子的研究多集中在陆生生物中,水生生物研究的较少,尤其是海洋微生物。2007年,日本工作者从海洋不等鞭毛藻类—无隔藻属中发现了一类新型转录因子,受到外界环境中蓝光的调控,命名为aureochromes (AUREOs),其由发挥转录因子功能的bZIP结构域和接受蓝光信号的LOV结构域组成。蓝光照射能够使LOV构象发生变化随后引起bZIP构象的变化,从而调控bZIP结构域与DNA结合的紧密性,影响基因的表达。目前已从海带、海链藻、长囊水云、金藻等多种海洋藻类中发现了该转录因子,但对其功能了解较少。本文从微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)转录组数据库中获得了编码另-AUREO的部分基因序列,命名为NgAUREOl。经RACE扩增获得其全长为2086bp,其中包括162bp的5’端非编码区、490bp的3’端非编码区以及1434bp的编码区,并成功导入了酿酒酵母细胞进行真核表达。获得的阳性克隆在显微镜下观察发现,与野生酵母细胞相比,重组酵母细胞变大；利用流式细胞仪分析重组酵母细胞中平均DNA和蛋白含量,结果表明,重组酵母中平均DNA含量由16提高到18.3、平均蛋白含量由3.75提高到6.28,进一步说明重组酵母细胞体积发生了明显变化。从影响酵母细胞大小的重要方面—细胞周期调控网络入手,分析NgAUREOl对酵母细胞大小的作用机理,根据AUREO识别并结合DNA核心序列(TGACGT)的特点,筛选了6个与细胞周期相关的基因(Pho85,Pho80, Pahl, Hspl2, Ies5和Bck2)。利用荧光定量PCR技术分析基因表达情况,经分析发现,有4个基因表达发生了显著变化,其中Pho85, Pho80和Pahl的表达量提高、Bck2表达量降低。因此,我们推断NgAUREOl可能通过调节细胞周期进程影响细胞大小。另外。本实验还对重组酿酒酵母的发酵能力进行了初步研究,对发酵48h的重组酵母和野生酵母的产乙醇能力进行测定,结果表明重组酵母具有较高的产乙醇能力,乙醇产量由野生酵母的9.68%增加到11.59%(v/v)。对重组酵母的发酵条件以及重要营养因子进行了优化,获得重组酵母以葡萄糖作为碳源,蛋白胨+酵母粉(质量比1：2)作为混合氮源以及在初始pH值6.0、接种量6%、培养温度30。C、转速220 r/min等条件下最适于生长。本研究加深了对AUREOs的功能性认识,为AUREOs应用于基因改造,实现外界光调理生物体内基因表达奠定了基础。
【关键词】：转录因子 AUREOs 细胞周期相关基因 酵母发酵能力
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS261.1;Q93
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文献综述13-34
• 1 转录因子13-20
• 1.1 转录因子的结构13-15
• 1.2 转录因子的分类及相关功能15
• 1.3 转录因子在基因工程中的应用15-16
• 1.4 人工转录因子16-17
• 1.5 转录因子研究方法17-20
• 1.5.1 研究转录因子功能的方法17-18
• 1.5.2 研究转录因子与DNA相关作用的方法18-20
• 1.5.3 转录因子系统研究方法20
• 2 蓝光调控性转录因子Aureochromes(AUREOs)20-24
• 2.1 AUREOs的结构特点21-22
• 2.2 AUREOs的功能特点22-23
• 2.3 AUREOs潜在应用—光遗传学23-24
• 3 细胞大小调控因素—细胞周期24-27
• 3.1 酵母细胞周期中两关键检测点的作用机制25
• 3.2 周期蛋白依赖激酶(CDKs)活性调节25-26
• 3.3 细胞周期网络对酵母细胞大小调控的分子机理26-27
• 4 生物质能乙醇的研究现状27-32
• 4.1 高性能发酵酵母的选育与改造28-30
• 4.1.1 自然筛选与适应性进化28
• 4.1.2 诱变育种28-29
• 4.1.3 原生质体融合与杂交29
• 4.1.4 代谢工程技术29-30
• 4.2 酵母发酵技术及工艺30-32
• 4.2.1 同步糖化发酵31
• 4.2.2 固定化发酵31-32
• 5 本课题立项依据及研究内容32-34
• 第二章 微拟球藻NgAUREO1基因的克隆及真核表达34-48
• 1 材料与方法34-42
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 藻种34
• 1.1.2 载体与宿主34
• 1.1.3 主要试剂及试剂盒34
• 1.1.4 主要仪器设备34-35
• 1.1.5 培养基35
• 1.1.6 所用引物序列见表135
• 1.2 方法35-42
• 1.2.1 微拟球藻的培养与收集35-36
• 1.2.2 微拟球藻总RNA提取与质量检测36-37
• 1.2.3 cDNA第一条链的合成37
• 1.2.4 RACE技术扩增微拟球藻NgAUERO1全基因序列37-38
• 1.2.5 NgAUREO1开放阅读框(ORF)序列的克隆38
• 1.2.6 目的片段的连接和转化38-39
• 1.2.7 重组表达载体的构建39-41
• 1.2.8 微拟球藻NgAUERO1基因的真核表达41-42
• 2 结果与讨论42-47
• 2.1 微拟球藻总RNA质量检测42-43
• 2.2 微拟球藻NgAUERO1全序列获得43-45
• 2.3 重组表达载体pAUR123-AUREO1的构建45-46
• 2.4 真核表达微拟球藻NgAUERO1基因46-47
• 3 小结47-48
• 第三章 NgAUREO1调控酿酒酵母细胞大小机理研究48-59
• 1 材料与方法48-51
• 1.1 材料48-49
• 1.1.1 实验材料48
• 1.1.2 主要试剂及仪器48-49
• 1.1.3 所用引物序列见表149
• 1.2 方法49-51
• 1.2.1 酵母细胞形态观察与生长曲线的建立49-50
• 1.2.2 流式细胞仪分析酵母细胞DNA和蛋白含量的测定50
• 1.2.3 NgAUREO1基因在酵母中的表达50
• 1.2.4 转基因酵母中细胞周期相关基因的表达分析50-51
• 1.2.5 蓝光实验51
• 2 结果与讨论51-58
• 2.1 转基因酿酒酵母细胞的基本特征51-53
• 2.2 流式细胞仪分析细胞DNA和蛋白含量53-54
• 2.3 NgAUREO1和细胞周期相关基因的转录表达分析54-57
• 2.4 蓝光对转NgAUREO1酵母细胞的细胞周期相关基因的影响57-58
• 3 小结58-59
• 第四章 转基因酵母发酵能力初步研究59-69
• 1 材料与方法59-63
• 1.1 材料59-60
• 1.1.1 实验材料59
• 1.1.2 主要试剂59
• 1.1.3 主要仪器设备59
• 1.1.4 培养基59-60
• 1.2 方法60-63
• 1.2.1 重铬酸钾溶液和DNS试剂以及标准品的配制60
• 1.2.2 标准曲线的建立60-62
• 1.2.3 转基因酵母与野生酵母发酵产乙醇能力测定62
• 1.2.4 转基因酵母培养条件的单因素试验62-63
• 1.2.5 转基因酵母培养基中碳源和氮源的优化63
• 2 结果与讨论63-68
• 2.1 转基因酵母与野生酵母发酵能力63
• 2.2 转基因酵母发酵条件的优化63-67
• 2.2.1 接种量的优化63-64
• 2.2.2 培养温度的优化64-65
• 2.2.3 初始pH的优化65
• 2.2.4 培养转速的优化65-66
• 2.2.5 培养时间的优化66-67
• 2.3 转基因酵母营养因子的优化67-68
• 3 小结68-69
• 全文总结69-71
• 参考文献71-78
• 致谢78-79
• 个人简历79
• 硕士期间发表的学术论文及研究成果79

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