粗糙脉孢菌C_2H_2突变株筛选及基因功能研究

发布时间：2017-10-13 03:23

  本文关键词：粗糙脉孢菌C_2H_2突变株筛选及基因功能研究

  更多相关文章： 粗糙脉孢菌 转录因子 纤维素酶 锌指蛋白 表达调控

【摘要】：丝状真菌的木质纤维素水解酶基因在可溶性诱导物的诱导作用下表达,其表达水平取决于转录激活子和阻遏因子的共同作用。因此,挖掘、解析这些纤维素酶基因表达调控关键的转录因子对提高木质纤维素水解酶的产量具有重要的理论指导和实际应用意义。为了进一步挖掘调控纤维素酶表达的新型转录因子,本研究以粗糙脉孢菌锌指转录因子C2H2家族的57株单基因突变体为研究对象,在以2%结晶纤维素为唯一碳源的培养条件下进行筛选,并且对这些突变体的发酵液中蛋白浓度、内切p-1,4-葡聚糖酶酶活、外切纤维素酶酶活、p-葡萄糖苷酶酶活及生物量进行了测定。结果显示,7株突变体的蛋白产量及内切β-1,4-葡聚糖酶酶活均比野生型有25%-77%不等的显著提高,而突变株NCU06487 (cea-1)、NCU 10006 (cea-2)的蛋白产量及内切β-1,4-葡聚糖酶酶活均比野生型有65%-80%不等的显著降低。为了进一步研究这两个转录因子在纤维素酶表达过程中的功能,首先,对突变株△cea-1和△cea-2进行了回补实验,证实了突变株蛋白和酶活的降低是由这两个转录因子基因缺失所引起的。同时,亚细胞定位实验显示这两个转录因子均定位于细胞核中。此外,△cea-1和△cea-2在纤维素条件下的转录组数据显示,由于cea-1和cea-2的缺失,大多数的纤维素酶基因明显下调。而且,这两转录因子的敲除显著影响纤维素酶表达调控因子(Clr-1、Clr-2)、碳代谢阻遏因子CRE-1等已知重要转录因子的表达水平。在野生型菌株背景下过表达实验表明提高cea-1和cea-2的表达水平可以显著提高蛋白产量和纤维素酶酶活。综上所述,转录因子cea-1和cea-2是调控纤维素酶基因表达的重要中枢调控因子。这两个新型纤维素酶表达调控因子的发现及功能的初步探索有助于进一步阐明纤维素酶表达调控网络的调控机制,为高产纤维素酶工程菌株的构建提供新素材和新思路。
【关键词】：粗糙脉孢菌 转录因子 纤维素酶 锌指蛋白 表达调控
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ925
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-18
• 1.1 木质纤维素降解8-13
• 1.1.1 纤维素酶系组成和作用方式8-9
• 1.1.2 纤维素酶诱导机制9-10
• 1.1.3 纤维素酶表达调控机制10-13
• 1.2 粗糙脉孢菌概述13-16
• 1.2.1 粗糙脉孢菌的基本特征13-15
• 1.2.2 粗糙脉孢菌在生物能源领域研究现状15-16
• 1.3 课题立项依据及目的意义16-18
• 1.3.1 课题立项依据16-17
• 1.3.2 课题研究意义17-18
• 2 材料与方法18-32
• 2.1 实验材料18-21
• 2.1.1 菌株18-19
• 2.1.2 质粒19-20
• 2.1.3 培养基20-21
• 2.2 仪器和试剂21-26
• 2.2.1 仪器21
• 2.2.2 试剂21-22
• 2.2.3 PCR引物22-26
• 2.3 分子生物学操作方法26-29
• 2.3.1 PCR反应26
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳26
• 2.3.3 质粒提取26-27
• 2.3.4 酶切反应27
• 2.3.5 连接反应27
• 2.3.6 琼脂糖凝胶切胶回收27
• 2.3.7 大肠杆菌转化27-28
• 2.3.8 SDS-PAGE电泳28
• 2.3.9 粗糙脉孢菌基因组提取28
• 2.3.10 粗糙脉孢菌RNA提取与纯化28-29
• 2.3.11 荧光定量PCR29
• 2.4 粗糙脉孢菌有性杂交29
• 2.5 粗糙脉孢菌转化29-30
• 2.6 摇瓶发酵30
• 2.7 蛋白及酶活测定30-31
• 2.7.1 蛋白测定30
• 2.7.2 酶活测定30-31
• 2.8 生物量测定31-32
• 3 结果与讨论32-54
• 3.1 C_2H_2家族突变体库筛选32-42
• 3.1.1 C_2H_2家族突变株的鉴定与保藏32-35
• 3.1.2 C_2H_2家族突变株蛋白及酶活测定35-37
• 3.1.3 突变株复筛验证37-42
• 3.2 CEA-1和CEA-2转录因子在纤维素酶表达调控中的功能研究42-54
• 3.2.1 △cea-1和△cea-2回补菌株构建及表征42-44
• 3.2.2 转录因子CEA-1和CEA-2过表达菌株构建及表征44-47
• 3.2.3 CEA-1和CEA-2在细胞中的定位47-48
• 3.2.4 转录因子CEA-1和CEA-2在纤维素酶表达调控中的作用48-53
• 3.2.5 小结53-54
• 4 结论54-56
• 5 展望56-57
• 6 参考文献57-64
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况64-65
• 8 致谢65-66
• 附录66

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨叶东,韩yN君,张金龙;纤维素酶的研究、生产及其在纺织上的应用[J];激光生物学报;2000年02期

2 汪测生;纤维素酶[J];山东纺织科技;2000年04期

3 汪多仁;纤维素酶在纺织工业中的应用[J];四川化工与腐蚀控制;2000年05期

4 孟雷,陈冠军,王怡,高培基;纤维素酶的多型性[J];纤维素科学与技术;2002年02期

5 张威;新一代的纤维素酶[J];国外纺织技术;2004年06期

6 刘桂荣,张鑫,郑明珠;纤维素酶的生产及应用前景[J];食品研究与开发;2004年01期

7 韩韫,蔡俊鹏;产纤维素酶海洋菌株的筛选及鉴定[J];现代食品科技;2005年03期

8 王菁莎,王颉,刘景彬;纤维素酶的应用现状[J];中国食品添加剂;2005年05期

9 赵荣乐;;纤维素酶研究进展[J];喀什师范学院学报;2005年06期

10 农向;伍红;秦天莺;向会耀;;纤维素酶的研究进展[J];西南民族大学学报(自然科学版);2005年S1期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 吕东海;周岩民;李如治;;饲用纤维素酶及其应用研究进展[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年

2 陈清华;冯钦龙;周辉;;纤维素酶生产的研究进展[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年

3 杨家华;郭志宏;;纤维素酶在反刍动物生产上的应用[A];中国奶牛协会2007年会论文集（上册）[C];2007年

4 曾涛;曾会才;陈汉清;;海南省部分纤维素酶高产菌株的分离与鉴定[A];2009年海南省微生物学检测及质量保证研讨会论文集[C];2009年

5 王凤超;陈冠军;刘巍峰;;环境基因组文库的构建及纤维素酶基因的筛选[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

6 王娟;李欣;吴松刚;黄建忠;;长梗木霉外切纤维素酶基因的克隆及其表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年

7 王骥;丁明;李燕红;陈清西;许根俊;赵辅昆;;动物内源性纤维素酶:福寿螺(Ampullaria crossean)多功能纤维素酶基因的克隆[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年

8 冯文英;;固体纤维素酶的浸渍条件优化及其特性研究[A];中国造纸学报2003年增刊——中国造纸学会第十一届学术年会论文集[C];2003年

9 赵辅昆;王骥;陈清西;许根俊;;纤维素酶的研究进展[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年

10 姚强;黄琰;陈冠军;;产耐碱性纤维素酶丝状真菌的筛选及研究[A];山东微生物学会第六次会员代表大会暨2004年学术年会论文集（上）[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 平远 译;纤维素酶可提高秸秆饲料利用率[N];福建科技报;2004年

2 河北农业大学动物科技学院 孙洪新邋甄二英;纤维素酶在动物营养中的应用[N];中国畜牧兽医报;2008年

3 王菁莎　王颉 刘景彬;纤维素酶的应用现状[N];中国食品质量报;2009年

4 刘国信;开发纤维素酶制剂大有可为[N];经理日报;2004年

5 陆慕寒 整理;35项印染行业节能减排先进技术——助剂篇(二)[N];中国纺织报;2008年

6 山东农业大学 王纪亭;饲料原料资源匮乏出路何在[N];中国畜牧报;2003年

7 ;2009年印染行业节能减排优秀技术创新成果推介[N];中国纺织报;2009年

8 冯卫东;科技将这样改变我们的生活[N];科技日报;2008年

9 ;高活力纤维素酶生产技术　[N];中国化工报;2002年

10 本报记者 李晓岩;生物炼制：突破纤维素利用瓶颈[N];中国化工报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张庆;瑞氏木霉纤维素酶降解模式及其功能多样性研究[D];山东大学;2015年

2 张聪;Cytophaga hutchinsoni纤维素酶系研究[D];山东大学;2015年

3 韩超;嗜热真菌新的热稳定纤维素酶的克隆、表达和功能研究[D];山东农业大学;2015年

4 吕新星;里氏木霉纤维素酶基因转录调控因子Xyr1功能研究及铜离子响应高效表达体系的建立[D];山东大学;2015年

5 王俊玲;嗜热内切纤维素酶AcCel12B的酶学性质研究[D];吉林大学;2015年

6 华梅;长白山森林土壤纤维素酶基因多样性分析及基因克隆与表达[D];东北师范大学;2015年

7 郭红;高固体系纤维素酶水解与回收强化研究[D];天津大学;2015年

8 刘奎美;纤维素酶转录调控因子及纤维素酶应用的研究[D];山东大学;2016年

9 周峻沛;云斑天牛胃肠道内共生细菌来源的纤维素酶和半纤维素酶的初步研究[D];中国农业科学院;2010年

10 韦小敏;斜卧青霉胞外蛋白质组学分析与纤维素酶合成调控机制研究[D];山东大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 耿月姗;纤维素酶在几种咪唑类离子液体中活性研究[D];天津大学;2009年

2 钱文佳;南极细菌产低温纤维素酶的研究[D];哈尔滨工业大学;2009年

3 舒勤;嗜碱性芽孢杆菌Bacillus sp.AC-2产纤维素酶的研究[D];浙江大学;2004年

4 赵燕;高效纤维素酶高产菌的筛选及相关研究[D];武汉科技大学;2013年

5 李娜;耐热真菌纤维素酶基因的克隆与序列分析[D];山东农业大学;2013年

6 田海娇;纤维素酶生产菌的筛选、诱变及产酶机制的初步研究[D];东北林业大学;2015年

7 訾晓雪;不同底物诱导下桦剥管菌纤维素酶活和蛋白质组学研究[D];东北林业大学;2015年

8 谭玲;高效水解甘油有机溶剂预处理麦草纤维素酶制剂的选择和复配[D];江南大学;2015年

9 张群;纤维素酶/木聚糖酶复合处理毛竹研究[D];江南大学;2015年

10 刘婷婷;四川黑茶渥堆过程中纤维素酶、果胶酶分泌菌株的筛选及其产酶条件优化[D];四川农业大学;2015年

，

本文编号：1022552