基于酶促改性的抗氧化丝素膜的制备

发布时间：2017-04-24 15:00

  本文关键词：基于酶促改性的抗氧化丝素膜的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丝素蛋白作为天然的高分子,具有良好的机械性能和生物相容性,在医学和组织工程等领域得到广泛应用。儿茶素是具有抗氧化作用的天然多酚化合物,对多种自由基具有清除功效。本文拟借助于生物酶法,将儿茶素接枝到再生丝素蛋白表面,提高丝素蛋白的抗氧化性能,拓展其应用领域。实验中考察了酪氨酸酶对三种儿茶酚的催化氧化作用,探究了酶用量、氧气浓度和反应时间对氧化反应的影响,借助于液相质谱(LC-MS)研究了儿茶素的氧化机理；以红外光谱法(FTIR)分析了酶催化儿茶素与氨基模型物(ε-聚赖氨酸,s-PLL)反应的可行性；以凝胶电泳法(SDS-PAGE)、高效液相(HPLC)和核磁共振氢谱(1H-NMR)技术手段,探究了溶液中酶促丝素与儿茶素反应后蛋白分子量分布及游离氨基数量的变化；结合DPPH和ABTS法测定了酶促丝素接枝儿茶素后膜材料的抗氧化性；通过计算NIH/3T3细胞在丝素膜样品的存活率,评价了膜材料的生物相容性。研究结果表明,儿茶素在酪氨酸酶催化氧化过程中,不仅生成多巴、多巴醌类物质氧化产物,还相互聚合生成部分二聚体；酶催化儿茶素与ε-PLL反应后,产物结构中具有儿茶素的苯环特征,表明儿茶素被催化氧化接枝到氨基化合物模型物中。SDS-PAGE和HPLC的分析结果表明,丝素蛋白接枝儿茶素后其分子量增加,1H-NMR也验证了酪氨酸酶催化儿茶素与丝素反应后,体系中伯胺基数量减少,上述方法与手段证实儿茶素与丝素蛋白分子间发生反应。丝素膜经1 U/mL酪氨酸酶、0.3 mM儿茶素在pH 7、20-30-C处理后,获得了一定的抗氧化性,且延长反应时间有利于增加膜材料的抗氧化性。酶促儿茶素接枝的丝素膜经过8 h洗涤后,其抗氧化性略高于未经酶处理的对照样,验证了酶法构建的抗氧化丝素膜有一定的持久性。从TG-DTG曲线可以看出,改性后丝素热力学性能无明显变化,NIH/3T3细胞在丝素膜样品及对照样上存活率均≥80%,表明改性丝素膜有良好的生物相容性,在医学及组织材料领域具有潜在的应用前景。
【关键词】：丝素蛋白 酪氨酸酶 儿茶素 抗氧化性
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS102.33
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-15
• 1.1 丝素蛋白8-9
• 1.1.1 丝素的组成与结构8
• 1.1.2 丝素蛋白的改性8-9
• 1.1.3 丝素蛋白的其他用途9
• 1.2 酪氨酸酶的结构和生理功能9-10
• 1.3 儿茶素10-13
• 1.3.1 儿茶素的种类及其结构特点10-11
• 1.3.2 儿茶素的抗氧化机理11-12
• 1.3.3 儿茶素的应用12-13
• 1.4 本课题研究的目的、意义和内容13-15
• 1.4.1 研究的目的和意义13
• 1.4.2 本课题研究内容13-15
• 第二章 实验材料、仪器和方法15-21
• 2.1 实验材料与试剂15-16
• 2.1.1 实验材料15
• 2.1.2 实验试剂15-16
• 2.2 实验仪器16
• 2.3 实验方法16-18
• 2.3.1 酪氨酸酶用量和氧浓度对儿茶酚催化氧化的影响16-17
• 2.3.2 酶催化氧化儿茶素体系溶氧量变化17
• 2.3.3 丝素蛋白溶液的制备17
• 2.3.4 丝素溶液浓度标定方法17
• 2.3.5 丝素蛋白膜的制备与醇化17
• 2.3.6 酪氨酸酶催化氧化丝素蛋白溶液17
• 2.3.7 酪氨酸酶催化儿茶素与丝素蛋白膜接枝17-18
• 2.4 测试方法18-21
• 2.4.1 多巴与多巴醌含量分析18
• 2.4.2 游离氨基含量分析18
• 2.4.3 高效液相色谱-串联质谱(LC-MS)18
• 2.4.4 SDS-PAGE18-19
• 2.4.5 HPLC19
• 2.4.6 ATR-FTIR19
• 2.4.7 核磁共振氢谱(~1H-NMR)19
• 2.4.8 丝素蛋白膜抗氧化性测定19-20
• 2.4.9 电镜扫描(SEM)20
• 2.4.10 热重法-微商热重法(TG-DTG)20
• 2.4.11 生物相容性20-21
• 第三章 酪氨酸酶催化氧化儿茶素的研究21-30
• 3.1 不同条件下对儿茶酚的催化效果21-25
• 3.1.1 时间对酪氨酸酶催化氧化儿茶酚的影响21-22
• 3.1.2 酪氨酸酶用量对酶催化儿茶酚的影响22-24
• 3.1.3 氧气的浓度酪氨酸酶酶活催化儿茶酚的变化24-25
• 3.2 酶催化氧化儿茶素产物组成及反应机制25-29
• 3.2.1 酪氨酸酶催化儿茶素氧化产物25-26
• 3.2.2 儿茶素酶催化氧化反应机理探究26-29
• 3.3 酶催化氧化儿茶素处理后反应液抗氧化性29
• 3.4 本章小结29-30
• 第四章 酶催化氧化儿茶素与丝素蛋白的反应机制30-40
• 4.1 酶促儿茶素与氨基模型物反应可行性30-32
• 4.2 酶促儿茶素接枝丝素蛋白的反应性32-34
• 4.2.1 SDS-PAGE与HPLC表征改性丝素分子量32-33
• 4.2.2 儿茶素与丝素反应中游离氨基的变化33-34
• 4.3 酶促儿茶素接枝丝素膜工艺与抗氧化相关性34-38
• 4.3.1 反应时间对抗氧化性的影响35
• 4.3.2 反应温度对改性丝素膜抗氧化性的影响35-37
• 4.3.3 DPPH法评价酶促儿茶素接枝丝素的持久性37
• 4.3.4 ABTS法评价酶促儿茶素氧化与丝素膜接枝后持久性37-38
• 4.4 本章小结38-40
• 第五章 丝素膜的微观结构及其生物相容性40-45
• 5.1 酶催化氧化儿茶素处理对丝素膜形态结构的影响(SEM)40
• 5.2 酶催化氧化儿茶素处理丝素膜热性能变化(TG-DTG)40-41
• 5.3 生物相容性41-44
• 5.3.1 细胞毒理性41-43
• 5.3.2 荧光染色观察43-44
• 5.4 本章小结44-45
• 第六章 结论与展望45-47
• 6.1 结论45
• 6.2 不足之处及未来展望45-47
• 6.2.1 不足45
• 6.2.2 展望45-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-51
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文51

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