酶法合成富含n-3 PUFA的磷脂酰丝氨酸的研究

发布时间：2017-05-18 17:07

  本文关键词：酶法合成富含n-3 PUFA的磷脂酰丝氨酸的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)是一种天然生物膜磷脂,存在于所有动植物、微生物细胞膜中,在大脑中含量丰富,约占大脑全部磷脂的10～20%。PS与脑功能密切相关,在提高认知、改善记忆力、治疗阿尔茨海默病、治疗抑郁症等方面有重要应用。本文研究了以富含n-3多不饱和脂肪酸(n-3polyunsaturated fatty acid, n-3 PUFA)的南极磷虾磷脂为原料,磷脂酶D(phospholipase D, PLD)催化合成PS的工艺条件,为进一步放大工业化生产提供依据。为了对反应过程进行监测,本文首先建立了磷脂的检测分析方法,包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和核磁共振波谱法(31P NMR). TLC采用氯仿：甲醇：水(65：25：4,v/v/v)为展开剂,碘蒸气显色,并结合Gelpro32软件对磷脂进行半定量分析。HPLC以硅胶柱为分析柱,采用正己烷/异丙醇/水体系作为流动相,蒸发光散射检测器,对洗脱程序和检测参数进行了优化,各磷脂组分均可以实现基线分离。31P NMR选用了胆酸钠体系来分析磷脂组成,对温度和pH进行了优化,各磷脂组分除SM和PE有部分重叠外,其余均可实现基线分离。TLC快速简便,适合初步检测,HPLC-ELSD和31P NMR定量分析准确。接下来本文以富含二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)的鱿鱼卵磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)和L-丝氨酸为原料,研究在PLD的磷脂酰基转移作用下催化合成n-3PUFA-PS的工艺条件。首先对PLD和反应体系进行了筛选,然后通过单因素及正交试验优化出制备PS的工艺条件：采用乙酸乙酯／水的双相体系,水相为20mM醋酸／醋酸钠溶液(含50 mM CaCl2,pH 4.5),底物质量比为1：32,有机相／水相体积比为5：6,加酶量40 U/mL,40℃搅拌反应6 h。在此最优水平下,由PC含量为30.09%,磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethnolamine, PE)含量为4.83%的虾油,制得PS含量为30.90%的n-3 PUFA-PS,其中含EPA 25.38%,DHA11.08%。为探讨PLD催化PC磷脂酰基转移生成PS对磷脂组成是否存在特异性,本文通过柱层析分离纯化出五种天然来源(蛋黄、大豆、南极磷虾、鱿鱼卵、冰岛刺参)的PC和PE,比较了不同来源PC和PE在PLD的催化作用下,酶法合成PS的差异,结果表明PLD催化PC酶法合成PS时确实对磷脂组成存在特异性,具体表现如下：(1)冰岛刺参磷脂因醚磷脂(烷氧型PC和缩醛型PE)的存在,其最终转化率低于其余四种原料,说明醚磷脂会抑制PLD的磷脂酰基转移活力；(2)PE的转化率小于PC,说明PC相对PE更适合作为PLD催化制备PS的底物； (3)对脂肪酸组成及酰基转移反应的相关动力学参数进行相关分析,得出PUFA含量越高,饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)含量越低,则反应速度越快；PLD对五种原料的特异性表现为蛋黄南极磷虾、鱿鱼卵冰岛刺参、大豆。本研究采用PLD催化制备n-3 PUFA-PS,避免了溶剂提取法的有机溶剂消耗量大、有毒、污染等问题,同时实现了南极磷虾的高值化利用,提高了其附加值,为n-3 PUFA-PS的健脑功能、抗疲劳等生物活性的研究提供一种新的功效因子,并为相关功能产品的开发提供原料。
【关键词】：磷脂酰丝氨酸 磷脂酶D n-3多不饱和脂肪酸 南极磷虾 磷脂
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 前言12-23
• 0.1 磷脂概述12-14
• 0.1.1 结构12-13
• 0.1.2 来源和性质13-14
• 0.1.3 功能和应用14
• 0.2 磷脂酰丝氨酸概述14-17
• 0.2.1 结构与性质14-15
• 0.2.2 分布与来源15-16
• 0.2.3 生理功能及应用16-17
• 0.3 磷脂酰丝氨酸的检测与分析17-20
• 0.3.1 薄层色谱法(TLC)17-18
• 0.3.2 高效液相色谱法(HPLC)18
• 0.3.3 质谱技术(MS)18
• 0.3.4 ~1H/~(13)C核磁共振波谱法(~1H/~(13)C NMR)18-19
• 0.3.5 ~(31)p核磁共振波谱法(~(31)P NMR)19-20
• 0.4 磷脂酰丝氨酸的制备方法20-22
• 0.4.1 提取法20
• 0.4.2 酶转化法20-22
• 0.5 本文研究目的及内容22-23
• 1 磷脂检测与分析方法的建立23-43
• 引言23-24
• 1.1 材料与仪器24-25
• 1.1.1 材料与试剂24
• 1.1.2 仪器与设备24-25
• 1.2 实验方法25-29
• 1.2.1 南极磷虾总脂的提取25
• 1.2.2 薄层色谱法分析磷脂组成25-26
• 1.2.3 高效液相色谱法定量分析磷脂组成26-27
• 1.2.4 核磁共振波谱法定量分析磷脂组成27-29
• 1.3 结果与讨论29-42
• 1.3.1 南极磷虾总脂的提取29
• 1.3.2 TLC分析磷脂组成29-30
• 1.3.3 HPLC分析磷脂组成30-35
• 1.3.4 ~(31)P NMR分析磷脂组成35-41
• 1.3.5 三种方法分析南极磷虾磷脂的结果比较41-42
• 1.4 小结42-43
• 2 富含n-3PUFA的磷脂酰丝氨酸的酶法合成工艺研究43-60
• 引言43
• 2.1 材料与仪器43-44
• 2.1.1 材料与试剂43-44
• 2.1.2 仪器与设备44
• 2.2 实验方法44-49
• 2.2.1 南极磷虾总脂的提取44
• 2.2.2 柱层析分离纯化PC44-45
• 2.2.3 检测分析方法45-46
• 2.2.4 磷脂酰丝氨酸合成的工艺优化46-48
• 2.2.5 提取条件的选择48-49
• 2.3 结果与讨论49-59
• 2.3.1 南极磷虾总脂的成分分析49-50
• 2.3.2 鱿鱼卵PC的柱层析分离纯化50-51
• 2.3.3 工艺条件的优化51-58
• 2.3.4 提取方法的比较58-59
• 2.4 小结59-60
• 3 磷脂组成差异对磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的影响60-70
• 引言60
• 3.1 材料仪器60-61
• 3.1.1 材料与试剂60-61
• 3.1.2 仪器与设备61
• 3.2 实验方法61-63
• 3.2.1 柱层析分离纯化PC和PE61
• 3.2.2 不同浓度的PC、PE转化PS61-62
• 3.2.3 检测分析方法62-63
• 3.3 结果与讨论63-69
• 3.3.1 五种原料PC的脂肪酸组成63-64
• 3.3.2 PC及PE纯度测定64-65
• 3.3.3 底物PC浓度对PS合成率的影响65-66
• 3.3.4 脂肪酸连接方式对PS合成的影响66-67
• 3.3.5 磷脂极性头部对PS合成的影响67
• 3.3.6 脂肪酸组成差异对PS合成的影响67-69
• 3.4 小结69-70
• 4 结论70-71
• 5 本论文创新点71-72
• 参考文献72-78
• 附录78-79
• 致谢79-80
• 个人简历80
• 在学期间发表的学术论文80

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