磷酸盐快速检测试剂盒的研发及应用
本文关键词:磷酸盐快速检测试剂盒的研发及应用
【摘要】:磷酸盐既参与微生物细胞组成如磷脂、核酸以及多种辅酶的合成,同时还在核心糖代谢途径EMP和HMP中发挥重要作用,因此,监控微生物细胞的磷代谢对微生物细胞生长与控制、代谢与代谢调控等方面具有重要意义,并有助于相关发酵过程控制新方法的建立提供新的依据。为此,本研究首先建立起磷酸盐的快速检测方法,并以此初步解析发酵过程中磷酸盐消耗与菌体生长、产物合成之间的关系,主要结果如下:通过对磷酸盐快速检测操作参数的研究,优化了磷酸盐快速定量测定方法,在此基础上组建磷酸盐快速检测试剂盒,考察了本试剂盒的使用方法、储存方法、测定pH以及测定温度。试剂盒检测的定量下限为9.75×10-8 mmol L-,检测误差为1-3.2%,最适测定pH范围为4.5-7.6。对复杂样本与处理方法进行了研究,获得样本预处理方法为:(1)待测样品与等体积的2 mol L-1 NaOH溶液混合,静置10 min;(2)在60℃条件下,向其中加入1/2体积的1 mol L-1 HCl,使沉淀消失;(3)再向其中加入2倍体积的无水乙醇,静置10min,12000 rmin-1离心5 min,取上清。运用本磷酸盐定量测定试剂盒,对多种常见培养基原料(包括酵母粉、蛋白胨和玉米浆粉等)以及多种微生物(如大肠杆菌、地衣芽胞杆菌和黑曲霉等)发酵过程中的磷酸盐含量进行了定量分析,所测得结果与用国标方法获得的结果一致。以重组大肠杆菌42-0#为研究对象,研究了发酵过程中磷酸盐含量变化规律,解析了大肠杆菌生长和产酶过程与磷酸盐消耗间的相关关系。通过摇瓶发酵试验,确定了发酵磷酸氢二铵和磷酸二氢钾的最适初始添加量分别为1.0 g L-、10.12 g L-,补加方式为:发酵培养基中补加总量的一半,剩余部分于发酵4 h后补加。在此基础上,重组大肠杆菌的细胞密度和赖氨酸脱羧酶的比酶活分别比原来提高了58.42%和14.09%。
【关键词】:磷酸盐 快速定量测定 发酵
【学位授予单位】:天津科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:TQ920;O655
【目录】:
- 摘要4-5
- ABSTRACT5-8
- 1 前言8-18
- 1.1 磷的理化性质及其作用8-9
- 1.1.1 磷的理化性质8
- 1.1.2 磷的作用8-9
- 1.2 磷参与的微生物生长过程中的主要代谢途径9-14
- 1.2.1 糖酵解途径9-11
- 1.2.2 磷酸戊糖途径11-13
- 1.2.3 甘油氧化途径13-14
- 1.3 微生物聚磷与解磷14-15
- 1.3.1 聚磷菌及其代谢模型14
- 1.3.2 解磷微生物及其作用机制14-15
- 1.4 磷的定量分析方法的研究进展15-16
- 1.4.1 钼酸铵分光光度法15
- 1.4.2 流动注射法(FIA)15
- 1.4.3 光谱法15-16
- 1.4.4 钼锑抗分光光度法16
- 1.4.5 微波消解法16
- 1.5 研究背景与主要研究内容16-18
- 2 材料与方法18-30
- 2.1 实验材料18-22
- 2.1.1 菌株18
- 2.1.2 实验仪器与设备18-19
- 2.1.3 实验药品与试剂19-21
- 2.1.4 培养基21
- 2.1.5 主要溶液与缓冲液21-22
- 2.2 实验方法22-30
- 2.2.1 国标法测定磷酸盐含量22-24
- 2.2.2 磷酸盐快速检测试剂盒的研发24-25
- 2.2.3 试剂盒测定的准确性及适用范围的确定25
- 2.2.4 监控磷酸盐含量和补加方式对重组菌42-025-29
- 2.2.5 好氧和厌氧条件下大肠杆菌培养29-30
- 3 结果与讨论30-52
- 3.1 磷酸盐快速检测测定方法的建立及其基本参数的评价30-38
- 3.1.1 溶液Ⅰ的选取30-31
- 3.1.2 溶液Ⅱ,溶液Ⅲ的保存及使用方法31-32
- 3.1.3 试剂盒显色结束后稳定性的研究32
- 3.1.4 试剂盒检测的定量下限32-33
- 3.1.5 影响试剂盒准确性的干扰因素及排除方法33-37
- 3.1.6 pH对磷酸盐含量测定的影响37
- 3.1.7 温度对标准曲线测定的影响37-38
- 3.2 快速检测试剂盒在不同类型样品中测定的准确性分析38-43
- 3.2.1 常见药品中磷酸盐含量分析38-40
- 3.2.2 大肠杆菌发酵过程中磷酸盐含量变化情况40-41
- 3.2.3 高温α-淀粉酶发酵过程中磷酸盐含量变化情况41-42
- 3.2.4 糖化酶发酵过程中磷酸盐含量变化情况42-43
- 3.3 监控磷酸盐含量和补加方式对大肠杆菌细胞密度和产酶水平的影响43-50
- 3.3.1 大肠杆菌培养中磷酸盐添加极限43-44
- 3.3.2 磷酸盐初始含量对大肠杆菌细胞生长及磷酸盐消耗的影响44-46
- 3.3.3 分批补加磷酸盐对大肠杆菌细胞生长及磷酸盐消耗的影响46-48
- 3.3.4 磷酸盐添加量和补加方式对大肠杆菌产酶水平的影响48-50
- 3.4 氧化磷酸化和底物水平磷酸化过程中磷酸盐的消耗情况比较50-52
- 4 结论52-53
- 5 展望53-54
- 6 参考文献54-61
- 7 攻读硕士学位期间论文发表情况61-62
- 8 致谢62
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