β1基因沉默对体外难治性癫痫细胞神经网络形成的作用及分子机制研究

【摘要】 第一部分Real-time qPCR检测大鼠Sombati难治性癫痫细胞模型中Integrin β1基因表达变化目的：整合素-跨膜系统主要介导细胞与细胞外基质的相互作用，本实验初步探讨在海马神经元的体外癫痫细胞模型中的细胞表面受体整合素β1（Integrin β1）在癫痫致痫性形成中的可能作用。方法：利用Neurobasal Medium无血清神经培养基和B-27因子体外培养SD新生乳鼠的海马神经元，对培养至第14天的细胞，参照Sombati的方法制备体外难治性癫痫模型，随机分为正常对照组（Control）、Sombati癫痫细胞模型组（低Mg2+），分别在用含有1mM Mg2+的pBRS液或低Mg2+的pBRS液培养细胞3h后，各组神经元在恢复维持培养基继续培养，在之后的第4天，采用Real-time qPCR方法检测Integrin β1的表达。结果：Sombati癫痫细胞造模后4天与正常海马神经细胞相比，Integrinβ1基因表达水平均明显高于正常海马神经细胞。结论：Integrin β1基因在Sombati癫痫细胞模型中表达增高，可能参与了难治性癫痫的形成过程。第二部分Integrin β1shRNA重组慢病毒载体的构建及其对Sombati难治性癫痫细胞Integrin β1基因表达的影响目的：构建Integrin β1基因RNA干扰慢病毒载体，为研究Sombati癫痫细胞模型Integrin β1的作用机制提供载体。方法:（1）针对Integrin β1目的基因序列，利用的RNA干扰序列设计软件，设计4个针对Integrin β1的RNA干扰靶点序列，构建4个shRNA慢病毒重组质粒，测序鉴定阳性克隆，常规培养HEK293T细胞，将慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进HEK293T细胞进行慢病毒包装、浓缩、滴度测定，并收集病毒。（2）常规培养PC12细胞，将构建的Integrin β1shRNA1-4转染PC12细胞，分为Integrin β1shRNANC组、Integrin β1shRNA1组、 Integrin β1shRNA2组、Integrin β1shRNA3组和Integrin shRNA4组，在倒置荧光显微镜下观察，估算慢病毒感染PC12细胞的效率，并采用Western blotting检测Integrin β1shRNA系统在PC12靶细胞中的沉默效果，以筛选出沉默效果最好的其中一条Integrin β1shRNA慢病毒载体。（3）常规培养至第11天的海马神经元，分别转染Integrin β1shRNA NC和筛选出来的沉默效果最好的Integrin β1shRNA2慢病毒，继续培养至第14天，参照Sombati方法制备体外难治性癫痫模型的方法，将已经转染Integrin β1shRNANC的细胞，用低Mg2+的pBRS液或者含有1mMMg2+的pBRS液分别培养细胞3h，同时将已经转染Integrin β1shRNA2慢病毒的细胞，用低Mg2+的pBRS液或者含有1mM Mg2+的pBRS液分别培养细胞3h，具体分组如下：正常海马神经元+Integrin β1shRNA NC、正常海马神经元+Integrin β1shRNA2、Sombati癫痫细胞模型组+Integrin β1shRNANC，Sombati癫痫细胞模型组+Integrin β1shRNA2，各组神经元均恢复维持培养基后继续培养，通过Western blotting检测其对海马神经元和Sombati癫痫细胞Integrin β1的基因沉默效果。结果：经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功，病毒达到有效滴度；Western blotting证实，重组慢病毒Integrin β1shRNA2感染海马神经元和Sombati癫痫细胞后Integrin β1蛋白表达显著下降。结论：成功构建Integrin β1RNA干扰慢病毒载体，并在新生大鼠海马神经元和Sombati癫痫细胞中实现有效的基因沉默效应。第三部分Integrin β1沉默后Sombati难治性癫痫细胞模型的FAK依赖相关信号通路蛋白表达变化目的：利用Integrin β1慢病毒载体转染Sombati癫痫细胞模型，探讨Integrin β1相关信号通路在致癫痫中的作用及其机制，为进一步阐明癫痫的发病机理提供科学依据。方法：利用Neurobasal Medium无血清神经培养基和B-27因子体外培养SD新生乳鼠的海马神经元，随机分为以下四组：正常海马神经元、Sombati癫痫细胞模型、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA NC、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA2，培养至第11天时，用Integrin β1shRNA NC感染Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA NC组的细胞，用Integrin β1shRNA2感染Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA2组的细胞，至培养第14天时，参照Sombati的方法制备体外难治性癫痫模型，对Sombati癫痫细胞模型组、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA NC组、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA2组用低Mg2+的pBRS液培养细胞3h，恢复维持培养基，再继续培养4天，正常海马神经元组则用含有1mM Mg2+的pBRS液培养细胞3h，恢复维持培养基，再继续培养4天，各组细胞均采用Western blotting检测信号通路蛋白Phospho-FAK(Tyr397)、Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1（Ser199/204）/PAK3蛋白表达水平。结果：与Sombati癫痫细胞+Integrinβ1shRNA2组相比，正常海马神经元、Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrin β1RNA NC的Phospho-FAK水平表达升高（P<0.01）；与正常海马神经元相比，Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrin β1RNA NC的Phospho-FAK水平表达升高（P<0.01），Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrin β1RNA NC组的Phospho-FAK水平无明显差异；在正常原代海马神经元、Sombati癫痫细胞模型以及转染了Integrin β1shRNA NC、Integrin β1shRNA2的Sombati癫痫细胞中，各组细胞的Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1(Ser199/204)/PAK3蛋白表达水平无明显变化。结论：Integrin β1在Sombati癫痫细胞中发挥作用依赖于FAK相关通路的激活，主要是启动了Tyr397磷酸化位点，但与Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和Phospho-PAK1（Ser199/204）/PAK3蛋白的激活无关。 

前 言  

目前，癫痫的发病机制仍不完全清楚，受到研究者们普遍关注的是离子通道学说和神经网络学说。神经网络学说认为，反复发作的易感性的存在是癫痫最为突出的病理生理特征。借助倒置荧光显微镜和双光子激发荧光成像技术观察电刺激下的转基因鼠的杏仁核，其神经突触末端可以与下位或者邻位神经元形成新的突触联系，随着癫痫的反复发作，这些初期可逆性突触异常连接逐渐成为固定的新连接，病理学研究发现其主要成分为苔藓纤维的芽生（Mossy fiber sprout，MFS），即与神经元树突形成新的轴突联系，引起异常兴奋性环路重建[3]。已有研究表明，癫痫的反复放电造成神经突起异常生长，生长锥结构改变，轴突改向，突触重构，最终形成异常的神经网络，其中的生长锥的异常生长和突触重构在难治性癫痫的难治性形成中起着关键的作用[4,5]。
因此，从整合素分子水平来研究突触重构和异常神经网络形成在癫痫发病机制中的作用将具有重要意义。本实验在前期研究的基础上，将按照Sombati[16-19]等方法制备癫痫细胞模型，采用Real-time qPCR 方法检测体外Sombati 癫痫细胞模型中的重要的神经元细胞表面受体整合素 β1（Integrin β1），探讨内源性Integrin β1对海马神经细胞生长的影响，探讨其在癫痫致痫性形成过程中的作用及其分子调节机制；通过构建慢病毒载体沉默内源性 Integrin β1，采用 Real-time qPCR 、Western blotting观察神经细胞生理生化的变化及Integrin β1 介导的相关胞内信号转导的变化，进一步完善整合素在癫痫致病中的分子机制研究。

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第一部分  Real-time  qPCR 检测大鼠 Sombati 癫痫细胞模型中 Integrin β1 基因表达变化 

1 材料和方法
荧光定量PCR仪 7500 Fast  ABI 公司
荧光显微镜  Olympus 公司
Olympus IX 51倒置显微镜  Olympus公司
SW-CJ-1F垂直单向流洁净工作台  苏州安泰空气技术有限公司
细胞培养箱  Thermo公司 
电子精密天平BS2245  北京赛多利斯仪器系统有限公司
 台式高速冷冻离心机3K-15  Sigma公司 
电热恒温干燥箱   上海跃进医疗器械厂
 立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX-40SII 上海申安医疗器械厂
 自动三重纯水蒸馏器SZ-97  上海亚荣生化仪器械厂

2 结 果
整合素是按不同的组合构成 24 种整合素，含β1 亚单位的整合素主要介导细胞与细胞外基质成分之间的粘附[20]。研究认为，Integrin β1 作为细胞重要的跨膜糖蛋白，广泛表达于神经系统，是重要的神经元表面细胞受体，是连接细胞外基质和细胞骨架蛋白的重要分子结构，可以与层粘连蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质成分结合，参与细胞外环境信息交换，维持细胞骨架，影响神经元极性，并介导神经元的分化、迁移，参与神经突触的形成及突触后介质的成熟，在神经生长发育过程中起重要作用[21-23]。它们不仅参与神经系统的发育和可塑性，而且和成熟神经元的病理状态密切相关。

第二部分Integrin β1 shRNA 重组慢病毒载体的构建及其对 Sombati癫痫细胞 Integrin β1基因表达的影响 ............... 29
 材料与方法…………29 
结果…………………………47 
讨论……………………………50 
第三部分  Integrin β1沉默后 Sombati癫痫细胞的FAK 依赖相关信号通路蛋白表达变化55
55材料与方法……………………55
 结果............64
 讨论………………………………65
 结论………………69

第三部分   Integrin β1沉默后 Sombati癫痫细胞的FAK 依赖相关信号通路蛋白表达变化

1 材料与方法
在第一部分中，我们实验结果提示在 Sombati 癫痫细胞中的 Integrin β1 异常高表达可能与癫痫的形成和发展相关，然而，其细胞内信号转导途径尚未十分清楚。Integrin β1 的主要生物学作用是介导细胞与细胞、细胞与外基质之间的相互粘附，其作为跨膜接头在细胞外基质与细胞内肌动蛋白骨架之间起双向的联络作用，目前研究认为，Integrin β1 主要通过激活两种酪氨酸依赖性通道发挥作用，即粘附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和 SHc 通道，本部分实验拟利用构建的 Integrin β1 重组慢病毒载体，沉默 Sombati 癫痫细胞中的内源性的 Integrin β1，对Integrin β1 在Sombati 癫痫细胞中的FAK 相关信号途径进行初步探讨。

2 结 果
整合素是以α和β两个亚基结合而形成的异二聚体糖蛋白，目前已经至少发现 24 种亚型[53,54]。整合素的α和β两种亚基都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，它们在结构上具有以下的共同特征：都有一个较长的胞外域、一个单次跨膜域和一个较短的无催化作用的胞内域（β4 亚基除外）。整合素β亚基分子量基本分布在90000-110000Da之间，根据β亚基种类的不同，可分为8 个（β1-β8）不同的亚家族，其中的整合素β1 亚家族又称为迟现抗原组（VLA）,β1(CD29)在体内广泛表达，β1 整合素亚单位可以与 CD49a-f（α1-α6）、CD51（αv）以及α7-α11 分别组成VLA-1 至 VLA-6、αvβ1（VNR-β1）、α7β1、α8β1、α9β1 和α11β1 整合素分子[55,56]。含β1 亚单位的整合素主要介导细胞与细胞成分之间的作用,与细胞骨架结构分子相互结合可以活化T 细胞，并调节CD 分子的活性,在整合素分子和配体结合过程中，最常见的识别序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD），即 RGD 序列,其可根据其识别的配体分子的不同，分为 3 大类，分别为：①识别 RGD 序列的整合素分子，包括α5β1、αvβ1；②识别非RGD 序列的整合素分子，包括α2β1、α4β1；③识别序列不明确的整合素分子，包括α1β1、α6β1、α7β1、α8β1 等[55]。

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结   论

1 结合我们前期的关于整合素研究成果，推测 Integrin β1 基因可能参与了难治性癫痫的形成过程，尤其是 Sombati 癫痫细胞持续自发性放电后的后期异常神经网络的重组过程。3通过 5'-GGAGGATTACTTCAGACTTCC-3'构建的慢病毒载体能在新生大鼠海马神经元和Sombati 癫痫细胞中实现有效的基因沉默效应。Integrin β1 在 Sombati 癫痫细胞中发挥作用依赖于 FAK 相关通路的激活，主要是启动了Tyr397磷酸化位点，但与Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和Phospho-PAK1 (Ser199/204) / PAK3 蛋白的激活无关。

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