基于蚕丝蛋白静电纺丝复合纳米纤维的构建及其相关应用研究

发布时间：2020-11-16 11:23

　　 静电纺丝技术构建的生物支架材料在组织工程领域具有巨大的应用潜力主要归因于其人为可控的纳米级纤维结构与化学组分能够充分模拟天然细胞外基质的结构与功能。目前,由天然的与人工合成的聚合物组成的复合纳米纤维能够结合天然组分的生物学特性与人工聚合物的可降解行以及力学性质,作为一种新型纳米结构生物支架材料在组织工程领域中得到了广泛的关注。在本论文中,首先,我们通过将无水相乳液乳化静电纺丝技术一步法构建基于天然蚕丝蛋白丝素蛋白(Silk fibroin,SF)与人工合成聚合物聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)功能性复合纳米纤维支架,并进行了系统的材料表征、药物释放与生物相容性的评估;第二,通过乳化静电纺丝技术构建了天然蚕丝蛋白丝胶蛋白(Silk sericin,SS)与PCL复合纳米纤维并系统的验证了其体内外生物相容性;最后,为了缓解静电纺丝支架非特异性蛋白吸附与细胞侵润的局限性,我们通过乳化静电纺丝构建了一种抵抗蛋白吸附、多孔的透明质酸(Hyaluronan,HA)/SF/PCL三元复合功能性纳米纤维支架。主要的内容与结果如下所列:①乳化静电纺丝构建SF/PCL“核-壳”结构纳米纤维与体外细胞相容性以及药物释放的研究我们通过无水相乳化电纺技术构建了SF/PCL“核-壳”的纳米纤维,使用扫描电镜、透射电镜、傅立叶红外光谱、X射线衍射、示差热量扫描、水接触角以及力学拉伸测量等多种技术针对纤维的理化性质进行了系统的表征,并解释了SF/PCL乳化电纺所产生“核-壳”结构的机制。异硫氰酸荧光素(FITC)体外释放实验评估了“核-壳”结构纳米纤维药物持续释放的潜力。我们发现增加SF组分比例能够增强整体纤维支架的亲水性同时降低纤维直径。通过甲醇处理后的SF/PCL纳米纤维支架中SF构象能够从随机卷曲模式向β-折叠结构转变,进而促进了纳米纤维的结晶行为并增强了材料整体的力学拉伸强度。体外细胞实验评估SF/PCL纳米纤维作为组织工程支架的应用潜力,结果证明混合材料能够促进皮肤成纤维细胞的粘附与增殖。我们的结果验证了单喷头乳化电纺技术构建的由天然蛋白SF与人工合成聚合物PCL“核-壳”结构纳米纤维的可行性,构建的复合纳米纤维支架具有持续的药物释放能力在组织工程领域中具有应用潜力,在理论与技术上为后续的实验奠定了基础。②乳化静电纺丝构建SS/PCL复合纳米纤维与体内外生物相容性研究目前,SF蛋白应用于生物材料设计是一个理想的选择与途径。然而,归因于免疫排斥反应、较弱的结构稳定性与高水溶性,SS作为蚕丝的另一种天然蛋白组分在生物材料领域并没有得到广泛的关注。我们首次通过解剖五龄蚕中部腺体提取天然状态下的SS蛋白进行后续的静电纺丝纳米纤维材料的构建与生物相容性的研究。为了提高SS蛋白的可纺性与材料结构的稳定性,使用PCL与SS进行混合并通过无水相乳化静电纺丝技术成功构建了纳米纤维支架。SS/PCL支架通过扫描电镜、透射电镜与傅立叶红外光谱等多种技术进行了系统的表征。力学拉伸测量与水接触角实验揭示了SS/PCL混合支架相比较于纯PCL支架能够加强材料的力学性质与亲水性。我们也分析了在混合支架中的SS组分对人源皮肤成纤维细胞1至5天培养后的细胞形态与增殖情况的影响,结果发现SS/PCL组分在合适的比例下能够明显促进细胞增殖同时出现了更加伸展的细胞形态。转化生长因子(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)与I型胶原的m RNA基因水平在SS/PCL支架中的表达出现了上调。最后,体内动物实验显示了SS/PCL支架相比较于纯PCL支架具有较低的纤维化组织的形成以及较少的巨噬细胞粘附,意味着这种生物相容性支架在组织工程领域中具有应用潜力。③乳化静电纺丝构建HA/SF/PCL三元复合纳米纤维与非特异性蛋白吸附以及细胞侵润的功能性研究前文中通过混合天然SF与人工合成聚合物PCL制备静电纺丝纳米纤维支架材料具有结合力学、结构、生物化学性质协同效用应用于组织工程领域。然而,纳米纤维结构过高的比表面积与固有的过小孔径能够导致大量的非特异性蛋白吸附与细胞难以侵润至材料内部的局限性。因此,我们构建了一种抵抗蛋白、多孔的纳米纤维支架,是由HA、SF、与PCL三种聚合物溶液混合并通过乳化静电纺丝技术构建的三元复合纳米纤维。我们对纤维支架的纳米结构、化学组分、力学性质、亲疏水性与蛋白吸附性等理化性质进行了表征与评估。溶胀与降解实验结果揭示了在整体支架内部定向孔结构的产生与纤维间孔径的增大。添加HA组分能够将当前的PCL/SF组分转化为亲水性的纤维,这种特性能够抑制非特异性蛋白吸附,从而导致降低体内纤维化组织的形成厚度与巨噬细胞的粘附。重要的是,PCL/SF/HA支架能够明显加强体外细胞侵润与体内组织向材料内部生长。人源皮肤成纤维细胞体外培养在PCL/SF/HA纳米纤维支架上表现出显著性增强细胞的增殖情况与细胞丝状伪足的产生,但是降低了I型胶原的表达。我们进一步发现,HA与PCL/SF/HA支架能够与细胞表面受体CD44相互作用激活TGF-β1/基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)信号通路进而有助于细胞迁移。这些发现证明PCL/SF/HA复合纳米纤维支架能够抵抗蛋白吸附并加强细胞侵润,为战胜静电纺丝技术的局限性提供了可能性。综上所述,本论文针对目前生物材料支架的一个重要研究热点-静电纺丝纳米纤维所面临的发展趋势,利用天然与人工合成高分子聚合物的无水相混合乳液通过静电纺丝技术构建复合功能性纳米纤维并验证了材料特性与生物学功能,能够为生物材料的开发与应用提供新的研究视角,对于组织工程与再生医学研究也具有一定的理论与实践的参考价值。
【学位单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R318.08;TB383.1
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 绪论
    1.1 问题的提出及研究意义
    1.2 静电纺丝技术国内外研究现状
        1.2.1 静电纺丝的基本原理
        1.2.2 静电纺丝纤维的影响因素
        1.2.3 乳化静电纺丝技术
    1.3 本课题的研究目的及内容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究内容
        1.3.3 创新点
2 乳化静电纺丝构建SF/PCL“核-壳”结构纳米纤维与体外细胞相容性以及药物释放的研究
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 实验材料与设备
        2.2.2 电纺溶液的制备
        2.2.3 静电纺丝
        2.2.4 纳米纤维支架的理化性质表征
        2.2.5 细胞培养
        2.2.6 细胞形态
        2.2.7 细胞活性检测
        2.2.8 FITC作为模式药物的释放行为检测
        2.2.9 统计分析
    2.3 结果
        2.3.1 PCL/SF纳米纤维的理化性质
        2.3.2 细胞形态
        2.3.3 细胞活性
        2.3.4 FITC的药物释放行为
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 乳化静电纺丝构建SS/PCL复合纳米纤维与体内外生物相容性研究
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验材料与设备
        3.2.2 电纺溶液的制备
        3.2.3 静电纺丝
        3.2.4 纳米纤维支架的理化性质表征
        3.2.5 细胞培养
        3.2.6 细胞形态
        3.2.7 细胞活性检测
        3.2.8 RNA提取与实时定量反转录PCR
        3.2.9 动物皮下移植
        3.2.10苏木精/伊红染色和免疫组化染色
        3.2.11统计分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 乳化电纺PCL/SS纳米纤维支架
        3.3.2 PCL/SS纳米纤维支架的材料组分与力学性质
        3.3.3 体外FEK4成纤维细胞响应PCL/SS支架：细胞形态与增殖情况
        3.3.4 细胞外基质TGF-β1，I型胶原与III型胶原的表达情况
        3.3.5 体内组织生物相容性
    3.4 小结
4 乳化静电纺丝构建HA/SF/PCL复合纳米纤维与非特异性蛋白吸附以及细胞侵润的功能性研究
    4.1 前言
    4.2 实验部分
        4.2.1 实验材料与设备
        4.2.2 电纺溶液的制备
        4.2.3 静电纺丝
        4.2.4 纳米纤维支架的理化性质表征
        4.2.5 细胞培养
        4.2.6 细胞形态（CLSM与SEM）
        4.2.7 细胞活性检测
        4.2.8 体外细胞侵润分析
        4.2.9 动物皮下移植
        4.2.10 HE和免疫组化染色
        4.2.11功能蛋白表达分析
        4.2.12 RNA提取与实时定量反转录PCR
        4.2.13统计分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 乳化静电纺丝构建PCL/SF/HA纳米纤维支架：组分与纳米结构
        4.3.2 材料化学与力学特性：β-折叠结构与力学强度
        4.3.3 溶胀与降解行为：定向大孔结构产生与孔径改变
        4.3.4 HA水合作用：材料亲水性与蛋白吸附性质
        4.3.5 体外FEK4成纤维细胞响应：细胞形态，增殖与胶原蛋白表达
        4.3.6 体内外生物相容性研究：细胞侵润与客体反应
        4.3.7 HA与PCL/SF/HA纤维支架的生物化学功能：CD44，MMP-2，-9 以及TGF-β1的表达
    4.4 小结
5 主要结论与后续建议
    5.1 主要结论
    5.2 后续建议
致谢
参考文献
附录
    A. 在攻读博士学位期间发表的论文
    B. 在攻读博士学位期间参加的科研项目情况

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 李海滨;李林昊;钱宇娜;蔡开勇;吕永钢;钟莉;刘万钱;杨力;;PCL/SS纳米纤维支架的制备及相容性研究[J];生物医学工程学杂志;2011年02期

本文编号：2886132