厌氧氨氧化细菌内纳米舱的结构与功能研究
发布时间：2021-02-24 10:24
厌氧氨氧化是地球氮循环的重要组成部分,也是污水生物脱氮和环境修复的重要基础,释放到大气中大约50%的氮可以归因于厌氧氨氧化活动。作为厌氧氨氧化的执行者,厌氧氨氧化细菌近年来已成为微生物、环境、地质等领域的研究热点,但对厌氧氨氧化细菌内部结构的研究仍处于起步阶段。特别是厌氧氨氧化细菌基因组中含有纳米舱基因位点,然而对于厌氧氨氧化细菌的纳米舱的功能和结构了解甚少。通过透射电镜观察厌氧氨氧化细菌的精细结构,发现在其外部存在一些类似于蛋白笼结构的同心圆环结构,其直径在50-60nm。然后设计一种新的方法（溶菌酶+磷脂酶）对厌氧氨氧化细菌内部物质进行分离,利用透射电镜发现在其内部也存在类似蛋白笼的结构,其直径在55-150nm之间。蛋白质谱检测数据也说明厌氧氨氧化细菌内存在纳米舱壳蛋白（cEnc）和载体蛋白（HAO）。综上推测在厌氧氨氧化细菌内部应该存在纳米舱。利用分子生物学的方法将纳米舱壳蛋白在大肠杆菌中进行表达,纯化,并基于透射电镜和原子力扫描电镜发现壳蛋白能够在体外自组装形成稳定的直径在34nm左右的球状颗粒。然后利用200KeV冷冻电镜解析球状颗粒的精细结构,发现在其内部还形成一个23n...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院重庆绿色智能技术研究院)重庆市
【文章页数】：164 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
NIR与c Enc-NIR的异源表达A SDS-PAGE分析B封装NIR酶的纳米舱的结构C,D NIR和c Enc-NIR氨基酸序列经胰蛋白酶消化和质谱分析检测到的序列片段(红色所示)
6.3.2 亚硝酸盐对模式菌活性的影响通过前面的实验可以看出,c Enc和NIR能够在模式生物大肠杆菌中进行正常表达。为了深入研究封装NIR酶的纳米舱的功能,首先对与c Enc结合的NIR的结构进行分析。通过利用Swiss建模分析,NIR与SMTL编号为4wtq.1的蛋白之间的相似度达到35%(如图6.4A所示)。然后通过分析可以发现在NIR模型是一种三聚体蛋白(图6.4B),其结构活性中心含有9个铜(II)离子(非共价键),2个氧原子(非共价键),1个甘油结合位点(非功能性粘合剂)(图6.4C箭头所示)。由此可以推测异源表达NIR酶应该需要额外补充铜(II)离子作为辅基。
通过前面的实验可以看出,c Enc和NIR能够在模式生物大肠杆菌中进行正常表达。为了深入研究封装NIR酶的纳米舱的功能,首先对与c Enc结合的NIR的结构进行分析。通过利用Swiss建模分析,NIR与SMTL编号为4wtq.1的蛋白之间的相似度达到35%(如图6.4A所示)。然后通过分析可以发现在NIR模型是一种三聚体蛋白(图6.4B),其结构活性中心含有9个铜(II)离子(非共价键),2个氧原子(非共价键),1个甘油结合位点(非功能性粘合剂)(图6.4C箭头所示)。由此可以推测异源表达NIR酶应该需要额外补充铜(II)离子作为辅基。为了验证NIR酶是否可以辅助细菌降解亚硝酸盐,使用分子生物学方法建立了两种不同类型的细菌,其中一种是带有pET-28a-NIR融合质粒的工程菌(EB),其能在诱导剂的条件下进行NIR的表达,另一种是不含pET-28a-NIR融合质粒的野生菌(WB)。利用野生型菌和工程菌按照1:50比例接种到新的5 mL LB培养基中。然后在恒温摇床中进行培养,温度为37℃,转速设定为180 rpm,培养2小时左右,使培养基细菌浓度OD600达到0.5-0.7左右。然后设置三组实验,对照组(WB)为野生菌,但在培养集中添加50 mg L-1亚硝氮。实验组1(WB+NO2-)也为野生菌,但在培养集中添加CuCl2(终浓度为0.1 m M),50 mg L-1亚硝氮。实验组2(EB+NO2-)为工程菌,然后在含有工程菌的培养基中加入IPTG诱导剂,并使其终浓度为0.1 mM,诱导工程菌产生NIR蛋白,并添加CuCl2(终浓度为0.1 mM),50 mg L-1亚硝氮。然后观察不同组大肠杆菌的生长量。如图6.5A所示,在实验进行的第一阶段,WB、WB+NO2-和EB+NO2-三者之间细菌的生长量是一致的。在第二阶段,当在WB+NO2-和EB+NO2-的培养基中分别加入CuCl2和亚硝氮后,与对照组相比,细菌的生长活性受到抑制。通过对比WB和WB+NO2-细菌的生长量的变化,可以看出NO2-的存在并不会对野生型细菌的生长产生抑制作用,有可能是因为铜(II)离子的存在导致细菌活性受到抑制。通过分析可以看出铜(II)离子能与NO2-形成络合物[Cu(NO2)4]2-,由此推测这种络合物可能会对细菌产生毒害作用。
【参考文献】：
期刊论文
[1]厌氧氨氧化菌的种类、特性与检测[J]. 胡倩怡,郑平,康达. 应用与环境生物学报. 2017(02)
[2]基于宏基因组技术获得的对厌氧氨氧化菌代谢的新理解[J]. 丁爽,郑平,陆慧锋,唐崇俭. 应用与环境生物学报. 2012(04)
本文编号：3049227
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院重庆绿色智能技术研究院)重庆市
【文章页数】：164 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
NIR与c Enc-NIR的异源表达A SDS-PAGE分析B封装NIR酶的纳米舱的结构C,D NIR和c Enc-NIR氨基酸序列经胰蛋白酶消化和质谱分析检测到的序列片段(红色所示)
6.3.2 亚硝酸盐对模式菌活性的影响通过前面的实验可以看出,c Enc和NIR能够在模式生物大肠杆菌中进行正常表达。为了深入研究封装NIR酶的纳米舱的功能,首先对与c Enc结合的NIR的结构进行分析。通过利用Swiss建模分析,NIR与SMTL编号为4wtq.1的蛋白之间的相似度达到35%(如图6.4A所示)。然后通过分析可以发现在NIR模型是一种三聚体蛋白(图6.4B),其结构活性中心含有9个铜(II)离子(非共价键),2个氧原子(非共价键),1个甘油结合位点(非功能性粘合剂)(图6.4C箭头所示)。由此可以推测异源表达NIR酶应该需要额外补充铜(II)离子作为辅基。
通过前面的实验可以看出,c Enc和NIR能够在模式生物大肠杆菌中进行正常表达。为了深入研究封装NIR酶的纳米舱的功能,首先对与c Enc结合的NIR的结构进行分析。通过利用Swiss建模分析,NIR与SMTL编号为4wtq.1的蛋白之间的相似度达到35%(如图6.4A所示)。然后通过分析可以发现在NIR模型是一种三聚体蛋白(图6.4B),其结构活性中心含有9个铜(II)离子(非共价键),2个氧原子(非共价键),1个甘油结合位点(非功能性粘合剂)(图6.4C箭头所示)。由此可以推测异源表达NIR酶应该需要额外补充铜(II)离子作为辅基。为了验证NIR酶是否可以辅助细菌降解亚硝酸盐,使用分子生物学方法建立了两种不同类型的细菌,其中一种是带有pET-28a-NIR融合质粒的工程菌(EB),其能在诱导剂的条件下进行NIR的表达,另一种是不含pET-28a-NIR融合质粒的野生菌(WB)。利用野生型菌和工程菌按照1:50比例接种到新的5 mL LB培养基中。然后在恒温摇床中进行培养,温度为37℃,转速设定为180 rpm,培养2小时左右,使培养基细菌浓度OD600达到0.5-0.7左右。然后设置三组实验,对照组(WB)为野生菌,但在培养集中添加50 mg L-1亚硝氮。实验组1(WB+NO2-)也为野生菌,但在培养集中添加CuCl2(终浓度为0.1 m M),50 mg L-1亚硝氮。实验组2(EB+NO2-)为工程菌,然后在含有工程菌的培养基中加入IPTG诱导剂,并使其终浓度为0.1 mM,诱导工程菌产生NIR蛋白,并添加CuCl2(终浓度为0.1 mM),50 mg L-1亚硝氮。然后观察不同组大肠杆菌的生长量。如图6.5A所示,在实验进行的第一阶段,WB、WB+NO2-和EB+NO2-三者之间细菌的生长量是一致的。在第二阶段,当在WB+NO2-和EB+NO2-的培养基中分别加入CuCl2和亚硝氮后,与对照组相比,细菌的生长活性受到抑制。通过对比WB和WB+NO2-细菌的生长量的变化,可以看出NO2-的存在并不会对野生型细菌的生长产生抑制作用,有可能是因为铜(II)离子的存在导致细菌活性受到抑制。通过分析可以看出铜(II)离子能与NO2-形成络合物[Cu(NO2)4]2-,由此推测这种络合物可能会对细菌产生毒害作用。
【参考文献】：
期刊论文
[1]厌氧氨氧化菌的种类、特性与检测[J]. 胡倩怡,郑平,康达. 应用与环境生物学报. 2017(02)
[2]基于宏基因组技术获得的对厌氧氨氧化菌代谢的新理解[J]. 丁爽,郑平,陆慧锋,唐崇俭. 应用与环境生物学报. 2012(04)
本文编号：3049227
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