枯草芽孢杆菌表面展示人胰岛素原及其口服降血糖功效评估

发布时间：2021-08-10 07:11

　　人胰岛素原（1uman proinsulin, HPI）是由109个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质,分子量约为12kD。HPI是人体唯一降血糖激素胰岛素的前体蛋白,体内和体外的研究均发现其能够有效降低胰高血糖素刺激的糖原分解,并结合胰岛素受体发挥生物学效应。人体内胰岛素水平的长期失衡容易引起糖尿病,随着人类社会的不断发展和人民生活水平的不断提高,糖尿病的患者人数也在不断上升,其中中国已经成为世界上糖尿病患者最多的国家,2010年中华内分泌学会和国家疾病控制中心调查18岁以上人群糖尿病患病情况,显示糖尿病患病率仍为9.7%。目前治疗糖尿病患者的方法主要是胰岛素的皮下注射和其他治疗,胰岛素的皮下注射给患者带来了极大的精神痛苦,也容易引起高胰岛素血症、体重增加和低血糖等并发症,并且糖尿病患者的治疗费用昂贵（美国每名糖尿病患者的年治疗费用达11744美元）,因此越来越多的研究开始专注于口服胰岛素制剂的开发,但是口服蛋白药物必须克服胃肠道极端环境对药物的破坏和吸收低下两大问题。枯草芽孢杆菌是一种非致病性革兰氏阳性益生菌,在极端环境的胁迫下能形成具有抗逆性的休眠体—芽孢。芽孢在酸性胃的环境中可以... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：115 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 糖尿病流行病分析
    1.2 糖尿病的分类及其治疗
        1.2.1 糖尿病分类
        1.2.2 糖尿病的治疗
            1.2.2.1 糖尿病的化合物治疗
            1.2.2.2 糖尿病的免疫治疗
            1.2.2.3 糖尿病的胰岛素治疗
            1.2.2.4 糖尿病的微生物治疗
    1.3 枯草芽孢杆菌概况
        1.3.1 枯草芽孢杆菌芽孢形成和构造
        1.3.2 芽孢表面展示系统和构建原则
        1.3.3 枯草芽孢杆菌在食品及医药行业中的应用
    1.4 家蚕疾病模型研究
        1.4.1 模式生物家蚕
        1.4.2 家蚕疾病模型研究
            1.4.2.1 家蚕肝病模型
            1.4.2.2 家蚕帕金森症模型
            1.4.2.3 家蚕高血糖模型
            1.4.2.4 家蚕其他疾病模型
    1.5 本研究的目的和意义
        1.5.1 主要研究内容
        1.5.2 研究的技术路线
第二章 人胰岛素原基因的克隆及其芽孢表面展示
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒和菌株
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器设备
        2.1.4 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 人胰岛素原基因hpi的克隆、测序及鉴定
        2.2.2 整合型重组质粒pJS700-HPI的构建
        2.2.3 重组枯草芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定
        2.2.4 表面展示人胰岛素原重组芽孢的诱导及鉴定
        2.2.5 Bacillus subtilis芽孢悬液的制备
    2.3 结果与分析
        2.3.1 人胰岛素原基因的克隆与鉴定
        2.3.2 重组整合型质粒pJS700-HPI的构建和鉴定
        2.3.3 重组枯草芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定
        2.3.4 CotC-HPI融合蛋白的表达及鉴定
    2.4 讨论与小结
第三章 家蚕高血糖模型的构建
    3.1 材料
        3.1.1 试剂
        3.1.2 实验材料
        3.1.3 仪器设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 葡萄糖溶液的配置和家蚕的微量注射
        3.2.2 家蚕血液糖类物质测定
        3.2.3 家蚕血液中葡萄糖含量的测定
        3.2.4 数据处理
    3.3 结果和分析
        3.3.1 各组家蚕体重和体长的观测
        3.3.2 家蚕血液的葡萄糖代谢分析
        3.3.3 各组家蚕血液总糖含量的测定
    3.4 讨论与小结
第四章 高血糖模型家蚕的差异蛋白质组学分析
    4.1 仪器与试剂
        4.1.1 实验仪器
        4.1.2 二维电泳相关试剂
        4.1.3 考马斯亮蓝染色相关试剂
        4.1.4 质谱鉴定所需试剂
        4.1.5 RNA抽提及RT-PCR试剂
    4.2 材料与方法
        4.2.1 家蚕高血糖模型构建
        4.2.2 蛋白质样品制备
        4.2.3 二维电泳
        4.2.4 二维凝胶图谱分析
        4.2.5 样品处理和质谱鉴定
        4.2.6 数据库比对
        4.2.7 差异蛋白的GO分析
        4.2.8 逆转录PCR(RT-PCR)
    4.3 结果
        4.3.1 高血糖模型家蚕中肠的形态差异
        4.3.2 高血糖模型家蚕中肠蛋白质组的差异
        4.3.3 差异蛋白的质谱鉴定
        4.3.4 差异蛋白的GO分析
        4.3.5 差异蛋白的RT-PCR分析
        4.3.6 差异蛋白的Western blot验证
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第五章 家蚕高血糖模型评估口服重组芽孢的降血糖功效
    5.1 材料与试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 高血糖模型家蚕的构建和重组芽孢的口添实验
        5.2.2 家蚕体重和体长的测定
        5.2.3 家蚕血液中血糖含量的测定
        5.2.4 家蚕血液蛋白的Western blot分析
        5.2.5 数据处理
    5.3 结果
        5.3.1 高血糖模型家蚕口添重组芽孢后的体重和体长观测
        5.3.2 各组家蚕血液总糖含量的测定
        5.3.3 家蚕口服芽孢后血液的Western blot分析验证
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
第六章 糖尿病模型小鼠对口服重组芽孢的验证
    6.1 材料与试剂
        6.1.1 实验材料
        6.1.2 试剂
        6.1.3 仪器设备
    6.2 实验方法
        6.2.1 链脲佐菌素溶液的配置和小鼠的腹腔注射
        6.2.2 小鼠血液中葡萄糖含量的测定
        6.2.3 糖尿病小鼠的分组和重组芽孢的口添实验
        6.2.4 小鼠血清中胰岛素水平测定
        6.2.5 数据处理
    6.3 结果
        6.3.1 小鼠糖尿病模型的造模结果
        6.3.2 小鼠血糖含量的测定
        6.3.3 小鼠血清胰岛素水平的测定
    6.4 讨论
    6.5 本章小结
第七章 总结和展望
    7.1 主要工作总结
    7.2 创新点
    7.3 展望
参考文献
致谢
博士期间发表的学术成果和参加的课题


【参考文献】：
期刊论文
[1]肠道菌群与2型糖尿病相关性的研究进展[J]. 尚婧晔,余倩.  中国微生态学杂志. 2014(12)
[2]二肽基肽酶-4抑制剂治疗2型糖尿病的临床研究[J]. 苏永,吕丽芳,李全忠,赵志刚,苏亚利.  中国糖尿病杂志. 2014(10)
[3]二甲双胍的临床应用与不良反应[J]. 莫宗琪,鞠晓华.  中国疗养医学. 2014(09)
[4]浅谈口服降糖类药物[J]. 张爱国,周家军.  海峡药学. 2014(08)
[5]新型抗感染药物研究模式生物——家蚕[J]. 陈明,章玉萍,代君君,涂文君,张丽丽,吴传华,刘健,范涛.  中国蚕业. 2014(03)
[6]浅谈2型糖尿病的基因检测[J]. 王雪涛,朱燕萍.  临床医药实践. 2014(07)
[7]解淀粉芽孢杆菌胞外多糖的理化性质及免疫调节作用[J]. 范熠,刘丽莎,韩玉竹,李平兰.  中国农业大学学报. 2014(01)
[8]关注糖尿病诊疗新标准[J]. 心洁,萧建中,韦玮,木子.  中老年保健. 2013(11)
[9]格列奈类药物在肥胖2型糖尿病治疗中的系统评价[J]. 仉媛媛,丛丽.  药品评价. 2013(09)
[10]枯草芽孢杆菌作为药物和免疫原投递载体的研究进展[J]. 岳敏杰,史媛媛,浮帅古,王彦彬,康相涛.  中国畜牧兽医. 2013(04)

硕士论文
[1]家蚕RAPD-SSR-AFLP三种分子标记综合连锁图谱的构建及图谱整合[D]. 姜振.苏州大学 2010
[2]一株枯草芽孢杆菌抗植物病原真菌活性物质的研究[D]. 鲁小城.浙江大学 2006



本文编号：3333721