酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控

发布时间：2017-08-30 15:01

  本文关键词：酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控

  更多相关文章： β-香树脂醇 三萜 合成生物学 CRISPR/Cas9 转录调控 酿酒酵母

【摘要】：β-香树脂醇是一种五环三萜化合物,也是其它齐墩果烷型三萜如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架,具有抗炎、抗细菌和真菌、抗病毒及癌细胞防治功效,在降血糖、降血脂方面也具有良好效果。与很多萜类相似,β-香树脂醇在植物中的含量很低,化学合成收率不高,因而限制了其规模化生产和广泛应用。为了提高β-香树脂醇的生产能力,本文利用代谢工程和合成生物学方法在酿酒酵母中构建其合成途径,经途径和发酵过程优化,实现β-香树脂醇的高效合成。研究结果如下:首先将光果甘草β-香树脂醇合酶基因进行密码子优化并采用质粒表达,气相色谱-质谱分析证明在工程酵母SpKb中成功合成了β-香树脂醇,产量为0.75±0.06 mg/L,单位细胞产量为0.07±0.02 mg/g DCW,为进一步通过途经改造提高β-香树脂醇生产奠定了基础。基于鲨烯处于三萜和甾醇合成途径分支点的特点,以鲨烯库存量为代谢途径平衡点,设计了“推拉式”途径优化措施调控β-香树脂醇合成。首先通过异源表达白色念珠菌鲨烯单加氧酶促进鲨烯向下游2,3-氧化鲨烯的转化,然后过表达大肠杆菌IPP异构酶、酵母自身FPP合酶和鲨烯合酶增强鲨烯供应,这种“推拉式”代谢策略使β-香树脂醇产量达到36.50±1.99 mg/L,提高了49倍。依据转录因子UPC2全局调控机理,将UPC2的DNA结合位点序列(SRE序列)重构于构建途径的ADH1p、ALA1p、GPM1p、TYS1p和FBA1p启动子中,启动子强度提高了42.2%~67.5%,强化了β-香树脂醇合成途径的整体表达效率,使其产量进一步提高到48.50±2.55 mg/L,在“推拉式”途径优化基础上提高了32.9%。为了下调竞争β-香树脂醇合成的内源甾醇和乙酰辅酶A代谢分流,设计并构建了CRISPR/dCas9系统,对报告基因LacZ的转录抑制研究发现,gRNA的结构是影响CRISPR/dCas9转录抑制效果的重要因素。进而设计了一步转化、组装多个gRNA进行多基因转录下调的方法,成功将甾醇合成相关的羊毛甾醇合酶基因ERG7和乙酰辅酶A代谢相关的乙醇脱氢酶ADH1/4/5/6、柠檬酸合酶CIT2和苹果酸合酶MLS2基因的7个gRNA实现了一步组装,组装效率达40%,7个基因的转录抑制率平均达75.5%,β-香树脂醇产量比未下调内源竞争代谢的对照菌提高了42.2%,表明CRISPR/dCas9系统在酵母途径工程优化应用中的潜力。通过对工程菌发酵生产β-香树脂醇的培养条件优化,获得最优的初始pH为5.0、接种OD为0.30、初始葡萄糖浓度为35 g/L。采用乙醇补料批式发酵,使β-香树脂醇的产量提高了90.2%。通过梯度补加甲基-β-环糊精,不仅实现了β-香树脂醇向胞外的转运,而且促进了β-香树脂醇的合成,乙醇补料批式发酵方式下β-香树脂醇的产量达到156.7±8.62 mg/L,单位细胞产量达18.44±1.91 mg/g DCW,分别比初始工程菌SpKb提高了209倍和263倍。
【关键词】：β-香树脂醇 三萜 合成生物学 CRISPR/Cas9 转录调控 酿酒酵母
【学位授予单位】：北京理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS261.11
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 前言14-15
• 第1章 绪论15-35
• 1.1 β-香树脂醇概述15-20
• 1.1.1 β-香树脂醇的结构与性质15
• 1.1.2 β-香树脂醇的生物活性与用途15-16
• 1.1.3 β-香树脂醇的来源16-18
• 1.1.4 β-香树脂醇的生物合成途径及在三萜合成中的地位18-20
• 1.2 工程化微生物细胞合成萜类化合物20-26
• 1.2.1 工程化大肠杆菌合成萜类化合物20-22
• 1.2.2 工程化酿酒酵母合成萜类化合物22-25
• 1.2.3 酿酒酵母合成 β-香树脂醇的研究现状25-26
• 1.3 酿酒酵母中人工途径的组装与调控26-34
• 1.3.1 DNA与途径组装技术26-29
• 1.3.2 酶表达水平的调控29-31
• 1.3.3 代谢途径酶的空间定位31
• 1.3.4 基于Cre/LoxP系统的基因敲除31-32
• 1.3.5 ZENs和TALENs基因组编辑技术32-33
• 1.3.6 CRISPR/ Cas介导的基因组编辑技术33-34
• 1.4 本课题研究的内容和意义34-35
• 第2章 β-香树脂醇合成途径在酿酒酵母中的构建35-55
• 引言35
• 2.1 材料35-39
• 2.1.1 菌种与质粒35-37
• 2.1.2 药品及试剂37-38
• 2.1.3 仪器38-39
• 2.1.4 培养基39
• 2.2 方法39-49
• 2.2.1 酿酒酵母的培养39-40
• 2.2.2 酵母基因组的提取40
• 2.2.3 目标片段的扩增与基因表达盒构建40-42
• 2.2.4 质粒的线性化42
• 2.2.5 DNA与质粒的组装42-43
• 2.2.6 酵母总RNA的提取及反转录43-44
• 2.2.7 基因表达水平检测44-46
• 2.2.8 菌体生物量的测定46-47
• 2.2.9 β-香树脂醇及其它代谢物的提取与测定47-49
• 2.3 结果与讨论49-53
• 2.3.1 β-香树脂醇合成途径在酿酒酵母中的构建49-50
• 2.3.2 β-香树脂醇合酶在酿酒酵母中的转录情况50-51
• 2.3.3 酿酒酵母工程菌SpKb发酵产物的鉴定51-52
• 2.3.4 不同表达载体对 β-香树脂醇合成的影响52-53
• 2.4 小结53-55
• 第3章 平衡前体物鲨烯代谢提高 β-香树脂醇合成55-78
• 引言55-56
• 3.1 材料56-58
• 3.1.1 菌种与质粒56-57
• 3.1.2 药品及试剂57
• 3.1.3 仪器57
• 3.1.4 培养基57-58
• 3.2 方法58-68
• 3.2.1 酵母基因组的提取58
• 3.2.2 大肠杆菌的基因组提取58
• 3.2.3 途径的构建与组装方法58-59
• 3.2.4 过表达鲨烯单加氧酶工程菌株的构建59-62
• 3.2.5 强化鲨烯合成工程菌的构建62-64
• 3.2.6 SRE在启动子中的重构与工程菌构建方法64-66
• 3.2.7 基因表达分析66
• 3.2.8 绿色荧光蛋白荧光强度检测方法66-67
• 3.2.9 其他分析方法67-68
• 3.3 结果与讨论68-77
• 3.3.1 外源鲨烯单加氧酶的表达与效果68-70
• 3.3.2 强化鲨烯供应提高 β-香树脂醇合成70-72
• 3.3.3 利用UPC2结合位点重构启动子增强途径表达效率72-74
• 3.3.4 过表达UPC2-1 对 β-香树脂醇合成的影响74-77
• 3.4 小结77-78
• 第4章 CRISPR/d Cas9修饰酵母内源途径优化 β-香树脂醇合成78-100
• 引言78-79
• 4.1 材料79-80
• 4.1.1 菌种与质粒79
• 4.1.2 药品及试剂79-80
• 4.1.3 仪器80
• 4.1.4 培养基80
• 4.2 方法80-90
• 4.2.1 目标片段的扩增与基因表达盒构建80-81
• 4.2.2 途径的构建与组装方法81
• 4.2.3 表达dCas9蛋白工程菌的构建81-82
• 4.2.4 CRISPR/dCas9验证系统的构建82-84
• 4.2.5 乙酰辅酶A合成强化工程菌的构建方法84-86
• 4.2.6 目标基因gRNA的设计与工程菌构建86-89
• 4.2.7 基因表达分析89
• 4.2.8 β-半乳糖苷酶活性的测定89-90
• 4.2.9 其他分析方法90
• 4.3 结果与讨论90-99
• 4.3.1 酿酒酵母中CRISPR/dCas9的设计90-91
• 4.3.2 dCas9蛋白表达模块的构建91-92
• 4.3.3 CRISPR/dCas9在酿酒酵母中的功能验证92-94
• 4.3.4 CRISPR/dCas9下调羊毛甾醇合酶94-96
• 4.3.5 强化胞质乙酰辅酶A合成96-97
• 4.3.6 CRISPR/dCas9一步多基因修饰 β-香树脂醇合成途径97-99
• 4.4 小结99-100
• 第5章 产 β-香树脂醇酿酒酵母的发酵工艺优化100-108
• 引言100
• 5.1 材料100-101
• 5.1.1 菌种100
• 5.1.2 药品及试剂100
• 5.1.3 仪器100-101
• 5.1.4 培养基101
• 5.2 方法101-102
• 5.2.1 种子液的制备101
• 5.2.2 2.5L发酵罐培养101
• 5.2.3 葡萄糖和乙醇浓度的测定101-102
• 5.2.4 其他分析方法102
• 5.3 结果与讨论102-107
• 5.3.1 基础培养条件的优化102-104
• 5.3.2 葡萄糖补料发酵104-105
• 5.3.3 乙醇补料发酵105-106
• 5.3.4 甲基-β-环糊精对 β-香树脂醇合成的影响106-107
• 5.4 小结107-108
• 第6章 结论与展望108-110
• 6.1 结论108-109
• 6.2 创新点109
• 6.3 对今后工作的建议与展望109-110
• 参考文献110-124
• 攻读学位期间主要研究成果124-125
• 致谢125-126
• 作者简介126

【共引文献】

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