GAPCs在细胞自噬和植物免疫中的功能研究

发布时间：2017-10-13 23:42

  本文关键词：GAPCs在细胞自噬和植物免疫中的功能研究

  更多相关文章： 细胞自噬 GAPCs ATG3 ROS 细胞死亡

【摘要】：细胞自噬是保守的细胞内代谢途径,参与多种生理过程,例如营养物质循环、发育、衰老、非生物逆境胁迫和抗病反应等。在植物中,细胞自噬能够受到活性氧(ROS)诱导而上调,参与胁迫相关的氧化蛋白的降解过程。目前并不清楚细胞自噬响应氧化胁迫受ROS调控的机制。ATG3蛋白是参与细胞自噬重要的酶,催化关键步骤ATG8的脂化。植物中ATG3不仅是细胞自噬通路中的关键组分,也参与免疫相关的细胞死亡的调控。本论文通过标签纯化串联质谱鉴定策略筛选ATG3在植物体内的互作蛋白,并通过生理、生化和遗传实验研究ATG3互作蛋白参与细胞自噬和影响植物抗病反应的分子机制。植物中,胞质定位的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPCs)有多个同源蛋白,除了在糖酵解中发挥生化酶活功能外,也参与胚胎发育、花粉管发育、根系生长、脂类代谢、种子油脂积累、ABA信号传导和ROS信号传导等其他多种生理过程。本论文首先鉴定了本生烟草中与ATG3互作的蛋白GAPCs。使用体内、体外多种互作实验证明了ATG3与GAPCs的特异互作。同时,我们发现氧化胁迫能够抑制ATG3与GAPCs的互作。沉默GAPCs能够组成型激活ATG3依赖的细胞自噬。瞬时表达实验显示,ATG3的过表达能够在烟草中激活细胞自噬,GAPCs的过表达可以抑制ATG3过表达诱导的细胞自噬;同样,过表达GAPCs也可以抑制ROS诱导的细胞自噬。另外,本论文研究了GAPCs在植物的免疫反应中的作用。沉默GAPCs可以增强N基因介导的细胞死亡,增强植物对不亲和病原Tobacco mosaic virus(TMV)和Pseudomonas syringae pvtomato DC3000(Pst DC3000)的抗性,同时还能增强烟草对亲和病原细菌P.syringae pv tabaci的抗性。本文揭示了ATG3互作蛋白GAPCs在细胞自噬和植物免疫反应中具有的多种作用。
【关键词】：细胞自噬 GAPCs ATG3 ROS 细胞死亡
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q946
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 第1章 前言11-27
• 1.1 细胞自噬11
• 1.2 植物细胞自噬的分子机制11-16
• 1.2.1 参与植物细胞自噬的保守基因11-13
• 1.2.2 参与细胞自噬的形成的蛋白组分13-16
• 1.3 植物细胞自噬的生理功能16-23
• 1.3.1 植物细胞自噬在植物的生长发育中的功能16-17
• 1.3.2 植物细胞自噬在植物的衰老中的功能17-18
• 1.3.3 植物细胞自噬在植物响应非生物胁迫中的功能18-20
• 1.3.4 植物细胞自噬在植物响应生物胁迫中的功能20-23
• 1.4 GAPDH是重要的多功能蛋白23-24
• 1.5 植物中GAPDH的功能研究24-27
• 第2章 材料与方法27-45
• 2.1 植物材料和生长条件27
• 2.2 载体构建27-29
• 2.2.1 功能载体的构建27-28
• 2.2.2 LIC载体构建28-29
• 2.3 培养基29
• 2.4 碱裂解法提取质粒29
• 2.5 植物DNA的提取29-30
• 2.6 琼脂糖凝胶回收纯化DNA30
• 2.7 大肠杆菌感受态的制备30
• 2.8 大肠杆菌的热激转化30-31
• 2.9 农杆菌GV3101感受态的制备31
• 2.10 农杆菌感受态的冻融转化31
• 2.11 免疫杂交31-32
• 2.12 烟草总蛋白Pull Down及互作蛋白质谱鉴定32-34
• 2.12.1 烟草总蛋白Pull Down32
• 2.12.2 SDS-PAGE胶蛋白电泳32
• 2.12.3 银染32-33
• 2.12.4 胶内酶切33
• 2.12.5 质谱鉴定分析33-34
• 2.13 荧光素酶互补实验34
• 2.14 蛋白表达验证以及免疫共沉淀（Co-IP）实验34-35
• 2.15 体外互作验证（Pull-down）实验35-36
• 2.16 双分子荧光互补（BiFC）实验36
• 2.17 细胞自噬观察36-37
• 2.17.1 CFP-NbATG8f分子标记观察36
• 2.17.2 MDC染色36-37
• 2.17.3 电镜观察37
• 2.17.4 细胞自噬小体的计数37
• 2.18 植物RNA提取、反转录PCR和实时定量PCR37-38
• 2.19 MV注射38
• 2.20 ROS检测38-39
• 2.20.1 NBT染色38-39
• 2.20.2 DAB染色39
• 2.21 病毒诱导基因沉默（VIGS）39
• 2.22 病毒侵染及荧光拍照39-40
• 2.23 病原菌生长检测40
• 2.24 细胞死亡实验40-41
• 2.24.1 细胞死亡诱导40
• 2.24.2 台盼蓝染色观察40-41
• 2.25 引物序列41-45
• 第3章 ATG3体内互作蛋白的筛选45-50
• 3.1 本章引言45
• 3.2 结果与分析45-48
• 3.2.1 ATG3体内互作蛋白筛选与分类45-47
• 3.2.2 GAPC是ATG3特异的互作蛋白之一47-48
• 3.3 讨论48-50
• 第4章 ROS负调控GAPCs与ATG3互作50-62
• 4.1 本章引言50
• 4.2 结果与分析50-61
• 4.2.1 GAPCs与ATG3均主要定位在胞质50-51
• 4.2.2 GAPCs与ATG3存在体内互作51-53
• 4.2.3 GAPCs与ATG3存在体外直接互作53-54
• 4.2.4 GAPCs与ATG3互作位于胞质中54-57
• 4.2.5 GAPCs与ATG3互作受ROS负调控57-61
• 4.3 讨论61-62
• 第5章 沉默GAPCs激活细胞自噬62-72
• 5.1 本章引言62-63
• 5.2 结果分析63-71
• 5.2.1 本生烟草中沉默GAPCs载体构建和表型观察63
• 5.2.2 VIGS基因沉默效率检测63-66
• 5.2.3 在本生烟中沉默GAPCs能够激活细胞自噬66-69
• 5.2.4 gapc拟南芥突变体中能够观察到细胞自噬激活69-71
• 5.3 讨论71-72
• 第6章 GAPCs负调控ATG3以及ROS诱导的细胞自噬72-82
• 6.1 本章引言72
• 6.2 结果与分析72-81
• 6.2.1 过表达ATG3可以激活细胞自噬72-76
• 6.2.2 过表达GAPCs可以抑制ATG3激活的细胞自噬76-77
• 6.2.3 过表达GAPCs可以抑制ROS激活的细胞自噬77-80
• 6.2.4 MV处理不影响ATG3的mRNA水平80-81
• 6.3 讨论81-82
• 第7章 GAPCs参与植物免疫反应82-88
• 7.1 本章引言82
• 7.2 结果与分析82-86
• 7.2.1 沉默GAPCs导致N基因介导的本生烟对TMV-GFP抗性增加82-83
• 7.2.2 沉默GAPCs导致N基因介导的HR细胞死亡加速83-84
• 7.2.3 沉默GAPCs导致对寄主病原细菌的抗性增加84
• 7.2.4 沉默GAPCs导致对非寄主病原细菌的抗性增加84-85
• 7.2.5 沉默GAPCs不影响非寄主抗性导致的细胞死亡85-86
• 7.3 讨论86-88
• 第8章 讨论与展望88-94
• 8.1 讨论88-93
• 8.1.1 ATG3-GAPCs互作在细胞自噬中的作用88-91
• 8.1.2 GAPCs在植物抗病性中的作用91-93
• 8.2 仍待解决的科学问题93-94
• 第9章 其他研究工作94-104
• 9.1 本章引言94
• 9.2 结果与讨论94-104
• 9.2.1 3IP2s主要定位在胞质94-96
• 9.2.2 3IP2s能够与ATG3在本生烟草中互作96-98
• 9.2.3 ATG3与 3IP2s互作位于胞质中98
• 9.2.4 沉默 3IP2s导致依赖于ATG3的细胞自噬激活98-100
• 9.2.5 沉默 3IP2s导致叶绿体形态受损100-101
• 9.2.6 过表达 3IP2s导致叶绿体降解加速101-104
• 参考文献104-114
• 致谢114-115
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果115-116

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王海杰;谭玉珍;;细胞自噬研究技术进展及其应用[J];中国细胞生物学学报;2011年07期

2 钱帅伟;漆正堂;支彩霞;丁树哲;;抑癌基因p53与细胞自噬[J];生命的化学;2011年05期

3 马泰;孙国平;李家斌;;细胞自噬的研究方法[J];生物化学与生物物理进展;2012年03期

4 向波;易梅;李小玲;李桂源;;细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用[J];生物化学与生物物理进展;2012年03期

5 王珂;;细胞自噬与肿瘤治疗的初步研究[J];科技风;2012年06期

6 杨智;;细胞自噬受蛋白质乙酰化调控[J];科学;2012年04期

7 ;乙酰化在细胞自噬调控中的功能及分子机制[J];中国基础科学;2012年05期

8 陶冶;任晓峰;;细胞自噬与病毒感染[J];病毒学报;2013年01期

9 何贤辉;何健;欧阳东云;;细胞自噬与炎症反应相互作用的研究进展[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2013年02期

10 李桂兰;闫华超;;细胞自噬与衰老[J];畜牧与饲料科学;2009年09期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 许赤;陈文捷;杨杨;李华;易述红;陈规划;;老年大鼠肝脏细胞自噬及其移植后改变[A];2013中国器官移植大会论文汇编[C];2013年

2 刘杰民;纪云西;蒋历;黄贵华;郑超伟;郭超峰;;细胞自噬是探索中医药微观机制的新思路[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十四次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2012年

3 李康生;代剑平;;病毒感染与细胞自噬[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年

4 杨键;邓玉杰;张晓燕;吕鹏飞;徐俊;杨颖;宁光;;脂肪细胞自噬检测方法的建立及意义探讨[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

5 陈英;朴英杰;;人肝细胞自噬性凋亡的形态学观察[A];第十二届全国电子显微学会议论文集[C];2002年

6 杨键;邓玉杰;张晓燕;吕鹏飞;徐俊;杨颖;宁光;;脂肪细胞自噬检测方法的建立及意义探讨[A];中华医学会糖尿病学分会第十六次全国学术会议论文集[C];2012年

7 赵颖;杨静;廖文娟;刘向宇;张辉;王杉;王冬来;冯京南;俞立;朱卫国;;胞浆中Fox01引起细胞自噬进而发挥抑制肿瘤的功能[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年

8 陈永;邹s舠，

本文编号：1027751