隐孢子虫和环孢子虫的全基因组测序及其在分型工具建立中的应用

发布时间：2017-10-23 05:25

  本文关键词：隐孢子虫和环孢子虫的全基因组测序及其在分型工具建立中的应用

  更多相关文章： 隐孢子虫 环孢子虫 全基因组测序 亚型区分 多位点序列分型

【摘要】：隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)和环孢子虫(Cyclospora spp.)是新发的食源性和水源性病原。每个属内均有多个虫种/基因型。其中,大多数虫种/基因型具有宿主特异性,但少数虫种宿主范围广,为人兽共患虫种。并且在同一虫种内部,不同分离株的毒力也有差异。但人们对虫种宿主范围差异、高毒力虫株产生的原因、新发的感染人的虫种的人兽共患性以及一些引起大规模暴发虫种的地理隔离性并不清楚。为此,本文针对这些问题开展了如下研究：1.针对目前这两个属已经测序的基因组少(隐孢子虫)或无(环孢子虫)是由于难以大量获得纯化病原和DNA的现状,我们首先建立了一种可用于隐孢子虫和环孢子虫全基因组测序的DNA分离、富集和质控方法。该方法采用蔗糖密度梯度离心、氯化铯梯度离心以及免疫磁分离(隐孢子虫)或流式细胞仪分选(环孢子虫)相结合的方法对粪便样品中的卵囊进行纯化,之后采用全基因组扩增(WGA)对从纯化卵囊中提取的DNA进行富集,最后采用qPCR和克隆Sanger测序的方法对WGA产物进行质控分析。通过对隐孢子虫6个虫种/基因型和卡耶塔环孢子虫的共25份粪便样品的WGA产物进行全基因组测序,证明了该方法的有效性。2.进一步采用以上方法,对人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)中常引起暴发的高毒力虫株(IbA10G2和IaA28R4的暴发株各两个)进行了测序,并与已报道的低毒力虫株(IaA25R3的TU502分离株)的基因组进行了比较,发现高毒力与低毒力虫株在所有染色体上都有明显的序列差异,但高毒力亚型分离株之间主要在6号染色体上有差异。进一步分析发现尽管在6号染色体的gp60位点(亚型区分位点)上,每个亚型都表现出各自亚型的特征,但在该位点之前和之后的位点,高毒力亚型常表现出其它亚型的特征,这表明遗传重组可能是人隐孢子虫高毒力亚型产生的遗传基础。3.由于人隐孢子虫主要感染人,而微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)为隐孢子虫属中最主要的人兽共患虫种,可感染人和反刍动物等,所以进一步对本课题中新测序的4个人隐孢子虫的分离株和已报道的这两个虫种基因组进行了比较,发现尽管两个虫种的基因组有97%的相似度,但还是存在一些虫种特异性基因。微小隐孢子虫在3条染色体(5,6和8号)上都有虫种特异性的基因,且这些基因都是属于近端粒区的多拷贝家族,包括MEDLE家族和类胰岛素酶。而人隐孢子虫只在3号染色体上有一个虫种特异性片段。这两个虫种基因组的高度相似性以及端粒区MEDLE家族和类胰岛素酶基因拷贝数的不同,表明端粒基因的重复可能是导致微小隐孢子虫宿主范围扩大的原因。4.隐孢子虫花栗鼠基因型I(Cryptosporidium chipmunk genotype Ⅰ)近年来在一些感染人的散发病例中被报道,但该基因型此前主要发现于啮齿类动物中,也偶尔在水源中被检出。为了解该该基因的人兽共患性,本课题在对该虫种测序的基础上,从其基因组中筛选出了gp60基因和mucm基因,建立了亚型区分方法,并对32个人源、野生动物源和水源的分离株进行了亚型区分,发现了15个gp60亚型,而且它们均属于同一家族。发现了2个mucin亚型,二者也仅相差一个重复序列的拷贝。人源和动物源分离株的遗传相似性说明该基因型具有人兽共患性。因此,该基因型感染人有可能是源于啮齿动物,并通过水源性途径进行传播。5.卡耶塔环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)是环孢子虫属中唯一可感染人的虫种,该虫种近年来已引起了多起食源性暴发。为了建立可用于溯源的分子工具,本课题首先对来自我国的一个分离株进行了全基因组测序,进一步筛选出5个多态性的位点,建立了具有高分辨率的多位点序列分型(MLST)工具。采用该工具对来自多个国家的64个样品进行分型,鉴定出了25个多位点序列类型(MLSTs),并发现这些MLSTs之间存在地理隔离。因此,本课题中建立的MLST方法有望被用于该虫种的地理来源追踪。综上,本课题建立了可用于隐孢子虫和环孢子虫全基因组测序的DNA的富集和质控方法,获得的全基因数据提高了我们对隐孢子虫宿主特异性和毒力差异的认识,同时还促进了高分辨率的分子溯源工具的建立。以上结果有助于了解隐孢子虫和环孢子虫的其它生物学特性,群体遗传结构,以及其它难培养病原的测序,从而为隐孢子虫病和环孢子虫病的防控提供理论依据。
【关键词】：隐孢子虫 环孢子虫 全基因组测序 亚型区分 多位点序列分型
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 第1章 文献综述15-40
• 1.1 隐孢子虫和环孢子虫概述15-23
• 1.1.1 临床症状和易感人群15-16
• 1.1.2 隐孢子虫和环孢子虫在我国人群中的分布16-17
• 1.1.3 主要的传播途径和感染来源17-20
• 1.1.4 对公共卫生的影响及防控策略20-23
• 1.2 隐孢子虫和环孢子虫的生物学特性23-29
• 1.2.1 隐孢子虫的分类学地位、形态和生活史23
• 1.2.2 环孢子虫的分类学地位、形态和生活史23-26
• 1.2.3 隐孢子虫的虫种和基因型26-28
• 1.2.4 环孢子虫的虫种和基因型28-29
• 1.3 隐孢子虫和环孢子虫的卵囊分离纯化技术29-32
• 1.3.1 漂浮法30
• 1.3.2 密度梯度离心30-31
• 1.3.3 免疫磁分离法31
• 1.3.4 流式细胞仪技术31-32
• 1.4 隐孢子虫和环孢子虫分子流行病学检测和分型工具32-35
• 1.4.1 基于隐孢子虫和环孢子虫的SSU rRNA基因的分子诊断工具32-33
• 1.4.2 基于隐孢子虫和环孢子虫的内转录间隔区的分子诊断工具33-34
• 1.4.3 基于隐孢子虫的gp60基因的分子诊断工具34
• 1.4.4 基于隐孢子虫的微卫星和小卫星序列的多位点序列分型工具34-35
• 1.5 隐孢子虫基因组学研究进展35-38
• 1.5.1 微小隐孢子虫和人隐孢子虫的基因组36
• 1.5.2 微小隐孢子虫和人隐孢子虫的比较基因组学研究36-38
• 1.6 本课题主要的研究内容和意义38-40
• 第2章 用于全基因组测序的隐孢子虫基因组DNA的分离、富集和质控方法40-55
• 2.1 引言40
• 2.2 实验材料40-45
• 2.2.1 样品采集40-41
• 2.2.2 实验仪器41-44
• 2.2.3 实验试剂44
• 2.2.4 数据分析软件44-45
• 2.3 实验方法45-49
• 2.3.1 卵囊纯化45
• 2.3.2 DNA提取和全基因组扩增45-46
• 2.3.3 检验WGA产物中隐孢子虫基因组含量46-47
• 2.3.4 检验WGA产物中隐孢子虫基因组DNA的纯度47-49
• 2.3.5 采用第二代测序技术对WGA产物进行全基因组测序49
• 2.4 实验结果49-52
• 2.4.1 全基因组扩增的效率49-50
• 2.4.2 采用克隆-Sanger测序法检测WGA产物的纯度50-51
• 2.4.3 采用第二代测序技术检测WGA产物的纯度51
• 2.4.4 WGA产物的基因组覆盖度51-52
• 2.5 讨论52-53
• 2.6 本章小结53-55
• 第3章 比较基因组学分析揭示人隐孢子虫高毒力亚型产生的遗传基础以及微小隐孢子虫广宿主的可能原因55-79
• 3.1 引言55
• 3.2 材料和方法55-56
• 3.2.1 样品采集55-56
• 3.2.2 实验仪器56
• 3.2.3 实验试剂56
• 3.2.4 数据分析软件56
• 3.3 实验方法56-60
• 3.3.1 卵囊纯化和全基因组扩增56
• 3.3.2 全基因组扩增产物的质量控制56
• 3.3.3 全基因组测序56
• 3.3.4 比较基因组学分析56-57
• 3.3.5 PCR验证57-60
• 3.4 实验结果60-76
• 3.4.1 人隐孢子虫的全基因组测序数据以及从头拼接60
• 3.4.2 测序基因组的覆盖度60
• 3.4.3 人隐孢子虫的基因组与微小隐孢子虫Iowa分离株的基因组的序列相似度及其物理结构特征60-68
• 3.4.4 微小隐孢子虫和人隐孢子虫特异性的序列68-71
• 3.4.5 与已报道的人隐孢子虫TU502分离株基因组的序列相似度71
• 3.4.6 人隐孢子虫高毒力亚型的基因组之间的序列相似性以及遗传重组的出现71-73
• 3.4.7 gp60位点重复序列区的样品内序列多样性73-76
• 3.5 讨论76-78
• 3.5.1 微小隐孢子虫和人隐孢子虫的基因组之间的相似性、基因的缺失和种特异性基因76-77
• 3.5.2 人隐孢子虫基因组间的序列相似性以及高毒力的人隐孢子虫亚型中的遗传重组77-78
• 3.6 本章小结78-79
• 第4章 隐孢子虫花栗鼠基因型Ⅰ的亚型区分工具的建立79-89
• 4.1 引言79
• 4.2 实验材料79-80
• 4.2.1 样品采集79
• 4.2.2 实验仪器79-80
• 4.2.3 实验试剂80
• 4.2.4 数据分析软件80
• 4.3 实验方法80-82
• 4.3.1 卵囊纯化和全基因组扩增80
• 4.3.2 全基因组扩增产物的质量控制80
• 4.3.3 全基因组测序80
• 4.3.4 gp60基因和cgd1_470 mucin基因的PCR80
• 4.3.5 PCR扩增产物检验80
• 4.3.6 PCR扩增产物测序80-82
• 4.3.7 PCR产物序列分析82
• 4.4 实验结果82-86
• 4.4.1 全基因组测序数据82
• 4.4.2 gp60基因特性82-84
• 4.4.3 gp60基因和cgd1_470 mucin基因的PCR扩增效率84
• 4.4.4 gp60亚型和mucin亚型84
• 4.4.5 gp60亚型间的进化关系84-86
• 4.5 讨论86-88
• 4.6 本章小结88-89
• 第5章 环孢子虫全基因组测序以及多位点序列分型方法的建立89-104
• 5.1 引言89
• 5.2 实验材料89-91
• 5.2.1 样品采集89-90
• 5.2.2 实验仪器90-91
• 5.2.3 实验试剂91
• 5.2.4 数据分析软件91
• 5.3 实验方法91-95
• 5.3.1 卵囊纯化91-92
• 5.3.2 卵囊DNA提取和全基因组扩增92
• 5.3.3 检验全基因扩增产物中环孢子虫基因组的含量92-93
• 5.3.4 检验WGA产物中环孢子虫基因组DNA的纯度93
• 5.3.5 全基因组测序93
• 5.3.6 微卫星和小卫星位点的PCR检测93
• 5.3.7 PCR产物检验93
• 5.3.8 PCR产物测序93
• 5.3.9 PCR产物序列分析93-95
• 5.4 实验结果95-102
• 5.4.1 全基因组扩增的效率95
• 5.4.2 卡耶塔环孢子虫的全基因组序列95-96
• 5.4.3 微卫星和小卫星序列的初筛96
• 5.4.4 初筛的遗传位点的扩增效率96
• 5.4.5 多态性遗传位点的扩增效率96
• 5.4.6 多态性位点的序列特征96-98
• 5.4.7 5个位点上不同序列类型之间的系统进化关系98-101
• 5.4.8 多位点序列类型101-102
• 5.5 讨论102-103
• 5.6 本章小结103-104
• 第6章 结论和创新点104-106
• 6.1 主要结论104
• 6.2 创新点104
• 6.3 展望104-106
• 参考文献106-128
• 攻读博士学位期间的研究成果128-129
• 致谢12

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