拟南芥WRKY12和WRKY13的基因功能研究

发布时间：2017-10-23 04:09

  本文关键词：拟南芥WRKY12和WRKY13的基因功能研究

  更多相关文章： 拟南芥 开花时间 WRKY12 WRKY13 DELLA 茎 倒伏 次生细胞壁

【摘要】：植物的开花早晚受到内外多种因素的影响,其中光照时间的长短是非常重要的因素。对于模式生物拟南芥来说,它在长光照环境下开花早,短光照环境下开花晚,且在短光照下的开花又受到植物激素赤霉素的调节。我们鉴定到WRKY12和WRKY13两个WRKY基因的突变体,发现它们在短光照下的开花时间与野生型不同,且是相反的趋势。其中wrkyl2突变体的开花时间比野生型晚,而wrkyl3突变体的开花时间比野生型早。我们对两个基因的表达模式进行了分析,发现它们均在茎尖和叶脉部位有表达。而且具体的时间表达谱有所不同,WKRY12基因随着苗龄的增长表达量有所上升,而WRKYl3基因随着苗龄的增长表达量有所下降。这一模式是符合两个WRKY基因在调控开花时间方面的功能的,即WRKY13基因作为一个开花抑制子,在早期较多表达,防止植物在不恰当的生长期开花,而WRKYl2基因作为一个开花促进子,在后期较多表达,保证植物能够顺利开花。我们进一步实施了启动子互换实验,即将WKRY12的启动子区域接到WRKY13的编码区域前面构建成表达载体,转入到wrky13的突变体,或是将将WKRY13的启动子区域接到WRKY12的编码区域前面构建成表达载体,转入到wrkyl2的突变体,这些转化对于开花时间的影响证实了两个基因的交错表达模式在共同调控开花时间方面的功能。 在茎尖处的调控开花的标志性基因FUL和SOC均在wrkyl2突变体中发生表达量下降,而在wrky13突变体中表达量上升。通过体内的染色质免疫共沉淀实验,我们证实了WKRY12和WRKY13蛋白可以直接结合FUL基因的启动子区域,从而直接调控其表达量。然后我们通过酵母双杂交系统筛选到和WKRY12, WRKY13均有相互作用的蛋白：GAI和RGL1。并且GAI和RGL1是与两个WRKY蛋白的DNA识别结合区域发生相互作用,这说明GAI和RGL1通过影响WRKY蛋白发挥其转录因子的作用,而间接调控下游基因的表达。GAI和RGL1是属于DELLA家族的两个蛋白。于短光照下促进植物开花的赤霉素是通过降解抑制子DELLA,释放出和DELLA相互作用的转录因子和被DELLA抑制的下游基因来起作用的。我们检测了拟南芥叶片中的GA含量时间谱,发现随着苗龄的增长,GA的含量也逐渐上升。这些证据放在一起使我们提出一个模型：即当植物生长到适当的阶段,含量上升的GA降解掉抑制子DELLA,释放出被其抑制的WRKY蛋白,而由两个WKRY基因组成的调控平衡也逐渐由抑制子WKRY13向WRKY12过渡,最终促进植物发生开花。 另外我们还发现了wrky13突变体在长光照下的倒伏表型。与此相对应的,进行了茎的拉断力测试实验后发现,拉断wrky13突变体的茎比拉断野生型的茎需要的力要少。表达谱分析表明WRKY13基因在茎中有强烈表达,并且从基部到顶端,随着组织成熟化的程度降低而表达量下降。对拟南芥的茎作横切面的切片染色观察后发现,和野生型相比,wrkyl3突变体的茎的直径更小,且其中厚壁组织的发育受到了阻碍。植物的茎中细胞可分为厚壁组织和薄壁组织两大类,厚壁组织和薄壁组织的区别在于薄壁组织只有一层细胞壁,而厚壁组织的细胞在第一层细胞壁外,还有第二层细胞壁,第二层异位沉积增厚的细胞壁主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成的。在第二层细胞壁的合成过程中起关键作用的一些调控因子,如：PAL4,4CL1, NST2, CesA7, CesA8等基因均在wrkyl3突变体中相比于野生型有所下降,我们进一步通过体内的染色质免疫共沉淀实验证实了WRKY13蛋白可以直接结合于NST2基因的启动子区域。以上这些结果共同证明了基因WRKY13能够通过直接或间接地调控厚壁组织细胞壁合成过程中的一些基因来影响茎中厚壁组织的发育,从而影响茎的支撑强度和植物的生长形态。
【关键词】：拟南芥 开花时间 WRKY12 WRKY13 DELLA 茎 倒伏 次生细胞壁
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一部分 ：一对WRKY基因拮抗调控拟南芥在短光照下的开花时间12-64
• 第1章 绪论14-32
• 1.1 拟南芥的开花时间的调控14-18
• 1.2 开花途径的信号整合18-20
• 1.3 DELLA蛋白20-22
• 1.4 GA的代谢调控22-24
• 1.5 WRKY转录因子24-31
• 1.6 主要研究内容和目的31-32
• 第2章 实验材料和方法32-42
• 2.1 植物材料和实验菌株32
• 2.2 基因克隆与分离试剂32-33
• 2.3 主要载体33
• 2.4 载体构建及转化33-34
• 2.5 农杆菌感受态制备及转化34-36
• 2.6 材料种植与处理36-37
• 2.7 核酸提取37-38
• 2.8 酵母双杂交38
• 2.9 染色质免疫共沉淀38-39
• 2.10 RNA反转39-40
• 2.11 荧光定量PCR40
• 2.12 GA含量测定40-42
• 第3章 实验结果42-60
• 3.1 WRKY12和WRKY13拮抗性地调节短光照下拟南芥的开花时间42-44
• 3.2 基因WRKY12和WRKY13的时间交错性的表达谱44-47
• 3.3 wrky突变体中一些基因表达量的变化47-50
• 3.4 体内实验证实WRKY12和WRKY13结合下游基因的启动子区域50-53
• 3.5 WRKY12/WRKY13蛋白和GAI/RGL1蛋白间存在相互作用53-56
• 3.6 植物激素GA在wrky突变体上产生的效应56-57
• 3.7 GA含量变化和GA对于WRKY基因的影响57-60
• 第4章 讨论60-64
• 4.1 WRKY基因在短光照下拮抗性地调控开花时间60
• 4.2 WRKY基因和MADS box基因的表达水平60-61
• 4.3 WRKY基因在短光照下调控开花时间的机制模型61-64
• 第二部分 ：拟南芥wrky13突变体的倒伏表型研究64-94
• 第5章 绪论66-78
• 5.1 植物的倒伏表型66-67
• 5.2 茎中的细胞分类67-72
• 5.3 调控次生细胞壁发育的转录因子72-75
• 5.4 WRKY对植物发育过程的调控75
• 5.5 主要研究内容和目的75-78
• 第6章 实验材料和方法78-80
• 6.1 植物材料和实验菌株78
• 6.2 主要载体78
• 6.3 转基因表达载体的构建78
• 6.4 材料种植与处理78-79
• 6.5 茎的拉断力的测试79
• 6.6 茎的切片和镜检79-80
• 第7章 实验结果80-94
• 7.1 wrky13突变体有倒伏表型80-83
• 7.2 WRKY13基因的表达模式分析83-85
• 7.3 WRKY13参与厚壁组织的发育过程85-87
• 7.4 WRKY13基因的突变导致了次生细胞壁相关基因的表达水平发生变化87-89
• 7.5 WRKY13与NST2启动子的结合89-94
• 第8章 讨论94-96
• 参考文献96-108
• 附录108-128
• 附录Ⅰ 缩略词108-109
• 附录Ⅱ 第一部分中用到的引物序列109-114
• 附录Ⅲ 第二部分中用到的引物序列114-116
• 附录Ⅳ 本研究中涉及到的主要的基因和蛋白序列116-128
• 致谢128-130
• 在读期间完成的学术论文与取得的研究成果130

【参考文献】

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1 吴同彦,谢令琴,杨学举,张彩英,陈荣芬;小麦株高构成因素与产量及其他性状相关性的研究[J];河北农业大学学报;2002年03期

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本文编号：1081514