Ccnyl1在精子发生过程中的功能研究

发布时间：2017-11-01 19:24

  本文关键词：Ccnyl1在精子发生过程中的功能研究

  更多相关文章： Ccnyl1 Cdk16 雄性不育 精子活力 精子发生 激酶活性 蛋白稳定性

【摘要】：细胞周期蛋白(Cyclins)是一类在细胞周期活动中起关键作用的蛋白。目前,Cyclins家族已经鉴定了很多成员,它们的共同特征是都含有保守的周期蛋白框序列(Cyclin Box)。通常,Cyclins与周期蛋白依赖性激酶(Cdks)相互作用,通过影响Cdks的蛋白激酶活性而发挥功能。虽然Cyclins/Cdks蛋白的功能最初在细胞周期活动中鉴定,但是目前研究发现,除调控细胞周期外,CyclinS/Cdks蛋白还可以参与调控很多其他细胞活动。Ccnyll是一个新鉴定的Cyclins蛋白成员,它与同家族中的Ccny蛋白有79%的序列相似性,但其功能尚未有研究。本研究发现Ccnyll基因特异高表达于小鼠睾丸组织中,而在其它组织中表达较低。由于Ccnyll与Ccny为同源蛋白,我们也检测了小鼠睾丸组织中Ccny的表达,发现在睾丸中Ccny的表达量远低于ccnyll。同时我们还检测了不同发育时期Ccnyll和Ccny在小鼠睾丸组织中的表达变化,结果显示Ccnyl从三周龄开始迅速表达,并在性成熟后达到高峰,然后趋于稳定表达；而Ccny的表达相对稳定,变化较小。组织切片免疫染色及流式分选实验结果显示,Ccnyll主要表达于处于减数分裂的生精细胞、圆形和延长形精子中。以上结果提示Ccnyll可能在精子生成过程中发挥重要作用。为阐明Ccnyll的功能,我们利用Ccnyll基因敲除小鼠(Ccnyll-/-)来进行研究。研究发现Ccnyll-/-小鼠生长发育正常；成年后,雌性小鼠具有正常生育能力,但是雄性小鼠不育。同时,我们也检测了Ccny-/-小鼠的生育能力,发现Ccny-/-雄性和雌性小鼠均能正常生育。以上结果表明是Ccnyll,而不是Ccny,在小鼠雄性生殖中发挥重要功能。为进一步研究探索Ccnyll-/-小鼠雄性不育的原因,我们检测了Ccnyll-/-小鼠雄性生殖器官的形态和重量,血清中睾酮和促卵泡激素的含量,生精小管的形态及结构,生精小管中各类群生殖细胞的数目和所占比例,各类群生殖细胞标志基因的表达水平,以及小鼠附睾头部和尾部的精子数目,但均没有发现明显差异。以上结果均表明Ccnyll不影响雄性生殖器官的发育、激素分泌以及精子生成和精子数目。我们利用Computer-assisted semen analysis(CASA)技术分析小鼠精子活力,结果显示Ccnyll-/-小鼠精子活力远远低于野生型小鼠。在相差显微镜下观察精子结构,我们发现与野生型小鼠的精子相比,ccnyll-/-小鼠的精子形态异常,表现为：精子头在颈部弯曲折向中段,中段和主段连接的区域变细,并发生弯折。在微分干涉差显微镜下观察精子结构,我们发现Ccnyll-/-小鼠精子的中段与主段连接区域的残滴结构缺失。后续的体外精子获能和体外受精实验结果显示,Ccnyll-/-小鼠精子获能正常,但是体外受精率严重下降。上述结果提示Ccnyll通过影响精子形态和精子活力进而导致小鼠不育。为进一步分析Ccnyll-/-小鼠精子结构异常及活力下降的原因,首先,我们用透射电镜观察精子结构,结果显示精子头部结构正常,但部分精子头部折向中段,并被残留的残体包住；精子中段与主段间的Annulus结构正常,但与线粒体脱离接触,间隙变大,导致此区域变细,并发生弯折。由于精子中段线粒体结构以及排列数均正常,线粒体标志蛋白Cytochrome C和Cytochrome c oxidase subunit 4的蛋白表达量没有明显差异,表明精子中段和主段间的间隙变大并不是由于线粒体缺失导致。其次,免疫染色发现,Ccnyll-/-小鼠的部分精子在中段与主段之间有微丝、微管散出,透射电镜结果也证实了这一现象,提示微丝、微管合成或组装可能存在异常,因此我们检测了精子中微丝、微管蛋白的表达。结果显示,Ccnyll-/-小鼠精子中α-tubulin的蛋白量与野生型小鼠没有差异,但β-actin的蛋白量显著增加。因此,我们检测了细胞骨架合成及组装相关蛋白的表达及活力,发现Ccnyll-/-小鼠精子细胞骨架的组装及解聚都没有异常。以上结果提示,Ccnyll-/-小鼠精子中β-actin蛋白量增加是由于头部与颈部的残体残留导致,而Ccnyll-/--小鼠精子微丝、微管散出可能是由于精子尾部折断导致的结构完整性被破坏而产生。Ccnyll是通过怎样的机制来影响精子的形态及功能呢?首先,我们利用睾丸组织的基因表达芯片来寻找靶基因(accession no.GSE67391),但Ccnyll-/-小鼠与对照小鼠之间的表达差异很小,提示Ccnyll可能并非通过转录调控发挥作用。其次,鉴于Ccnyll和Ccny是高度同源蛋白,文献报道Ccny可以与Cdkl4相互作用而调节经典Wnt信号通路。因此我们检测了经典Wnt信号通路相关蛋白,但均没有发现明显变化,提示Ccnyll并不参与调节经典Wnt信号通路。通过比对已知的基因缺失或突变小鼠表型,我们发现Ccnyll-/-小鼠表型与Cdkl6-/-小鼠表型类似。因此我们检测了Ccnyll-/--小鼠睾丸组织中Cdk16的表达,发现Cdk16 tuRNA表达水平与对照组小鼠没有差异,但Cdk16蛋白水平显著低于对照小鼠。提示Ccnyll与Cdk16蛋白之间存在相互作用。免疫荧光共定位结果显示Ccnyll与Cdkl6在睾丸组织中存在共定位,特别是在延长形精子中。体内及体外免疫共沉淀结果也进一步证实Ccnyll与Cdk16之间存在相互作用。Ccnyll与Cdkl6相互作用,并且Ccnyll缺失导致Cdkl6蛋白水平下降,由此我们推测,Ccnyll可能影响Cdk16蛋白稳定性或Cdkl6的翻译。通过蛋白稳定性实验以及抑制蛋白降解实验,我们发现Ccnyll与Cdkl6结合后能显著增强彼此的蛋白稳定性。此外,我们发现在Ccnyll-/-小鼠的睾丸组织中,Cdkl6蛋白的条带位置略低于对照组,碱性磷酸酶处理后,两组之间的差异消失,提示两组小鼠的Cdkl6蛋白磷酸化修饰存在差异。通过质谱技术,我们鉴定了Cdk16的磷酸化修饰位点,发现Cdk16蛋白的氮端高度磷酸化。我们共鉴定出了22个磷酸化位点,其中19个可信位点。在这19个可信位点中,有9个位点是从未报道过的新位点,分别是S36、S64、S65、S89、S146、T175、T380、S391和S478。当Ccnyl1与Cdkl6共表达时,Cdkl6的S36、S146、T175和S480位点磷酸化水平显著增强,而S78磷酸化水平显著降低,说明Ccnyl1结合会影响Cdkl6的磷酸化修饰。为验证Cdk1 6磷酸化修饰对其与Ccnyl1相互作用的影响,我们构建了点突变克隆,并发现Cdkl6氮端的磷酸化修饰对Cdkl6与Ccnyl1的结合具有重要作用。另外,酶活实验结果显示,Cdk16自身激酶活性很低,但与Ccnyl1结合后酶活显著增强。在新鉴定的Cdk16磷酸化位点中,S146磷酸化对Cdkl6与Ccnyl1的结合至关重要。S146A及S146D突变都引起Cdkl6自身激酶活性降低,同时阻断Cdk16与Ccnyl1的结合。因此Cdk16的磷酸化修饰不仅影响与Ccnyl1蛋白结合,影响彼此的蛋白稳定性,而且也会影响自身的激酶活性。总之,我们的研究首次揭示了Ccnyl1的功能,并阐明Ccnyl1通过与Cdkl6相互作用,在精子生成及雄性生殖中发挥至关重要的作用。鉴于Ccnyl1的表达特异性,且并不影响小鼠生长发育及激素水平,Ccnyl1可以作为研发干预雄性生殖药物的理想靶点。此外,越来越多的小鼠模型中的研究不断丰富了我们对雄性不育基因因素的认识,这将对临床诊断、治疗及转化研究提供重要理论依据。
【关键词】：Ccnyl1 Cdk16 雄性不育 精子活力 精子发生 激酶活性 蛋白稳定性
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q492
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第1章 绪论14-42
• 1.1 周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶14-22
• 1.1.1 周期蛋白和周期蛋白依赖蛋白激酶概述14
• 1.1.2 周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶复合物14-15
• 1.1.3 Cyclins/CdKs蛋白复合物的功能15-22
• 1.2 精子发生过程22-36
• 1.2.1 小鼠雄性生殖系统22-23
• 1.2.2 小鼠睾丸结构及生精小管的组成23-25
• 1.2.3 精子的生成过程25-29
• 1.2.4 精子发生的调控29-33
• 1.2.5 不同类型的生殖细胞的特点及分选33-36
• 1.3 精子的结构36-40
• 1.4 受精过程及雄性不育40-42
• 第2章 Ccnyl1在精子发生过程中的作用研究42-96
• 2.1 实验方法与材料42-63
• 2.1.1 细胞系及培养42
• 2.1.2 小鼠模型42-43
• 2.1.3 Western Blot实验43-46
• 2.1.4 RNA的抽提及Realtime-PCR实验46-48
• 2.1.5 细胞和组织的Co-IP实验48-49
• 2.1.6 激酶活性检测实验49-50
• 2.1.7 分离睾丸中的生殖细胞、流式细胞仪分选或检测和Ca~(2+)、pH检测50-51
• 2.1.8 组织石蜡切片、免疫组化、HE染色及免疫荧光51-54
• 2.1.9 芯片和质谱实验54
• 2.1.10 Testis和Sperm透射电镜实验54-55
• 2.1.11 精子活力检测实验(CASA)、精子计数、和精子获能实验55-57
• 2.1.12 小鼠基因型鉴定57-58
• 2.1.13 精子涂片58
• 2.1.14 Testis、Germ cells、Sperm的G/F-Actin分离实验58-59
• 2.1.15 RhoA/Cdc42/Rac1活性检测59
• 2.1.16 血清中睾酮和促卵泡素含量检测59-60
• 2.1.17 体外受精实验60
• 2.1.18 其他实验试剂、仪器和抗体60-63
• 2.2 实验结果63-92
• 2.2.1 Ccnyl1与Ccny蛋白具有高度同源性63
• 2.2.2 Ccnyl1和Ccny基因表达图谱63-65
• 2.2.3 Ccnyl1主要表达于减数分裂的生精细胞以及圆形精子和延长形精子中65-67
• 2.2.4 Ccnyl1定位在细胞膜上67-68
• 2.2.5 Ccnyl1基因敲除小鼠构建及鉴定68-69
• 2.2.6 Ccnyl1敲除小鼠表现为雄性不育69-71
• 2.2.7 Ccnyl1-/-小鼠体重和生殖器官重量正常71-72
• 2.2.8 Ccnyl1基因敲除小鼠的雄性激素水平正常72-73
• 2.2.9 Ccnyl1不影响精子发生73-74
• 2.2.10 Ccnyl1-/-小鼠精子活力下降74-75
• 2.2.11 Ccnyl1-/-小鼠精子获能正常和体外受精能力严重下降75-76
• 2.2.12 Ccnyl1-/-小鼠精子形态异常76-80
• 2.2.13 Ccnyl1不通过经典的Wnt信号通路发挥作用80-81
• 2.2.14 Cdk16在睾丸组织中特异高表达,Ccnyl1缺失导致Cdk16蛋白水平下降81-83
• 2.2.15 Cdk16与Ccnyl1之间存在相互作用83-85
• 2.2.16 Ccnyll和CMkl6的相互作巧影响两者的蛋白稳定性85-87
• 2.2.17 Ccnyl1与Cdk16相互作用调节Cdk16磷酸化修饰及激酶活性87-92
• 2.3 结论与讨论92-96
• 参考文献96-108
• 附录108-116
• 致谢116-118
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果118

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴靖;;精子发生的计算机模型[J];国外医学.生物医学工程分册;1991年02期

2 张桂元;关于精子发生、附睾精子成熟和精子功能的研究课题基金资助申请[J];实用男科杂志;1997年02期

3 李碧春,钱菊汾;精子介导外源DNA转移的研究进展[J];动物医学进展;2000年04期

4 单玉喜,晏鹏,吴孝兵,李建民;人类Y染色体上与精子发生相关的基因的研究进展[J];安徽师范大学学报(自然科学版);2001年02期

5 单玉喜,吴孝兵;差异显示法克隆精子发生相关基因[J];中华男科学;2001年01期

6 白文俊,侯树坤,王晓峰,闫征,何培英,田世河,邓庆平;肿瘤坏死因子受体在人精子的表达及其意义[J];中华泌尿外科杂志;2002年03期

7 李泽廷;桂耀庭;蔡志明;;精子发生中几个关键基因的研究进展[J];国际泌尿系统杂志;2006年02期

8 侯仕农;高雪梅;闫强;;精子介导转基因技术研究进展[J];华北农学报;2006年S3期

9 周兴;张居农;;精子载体转基因技术研究进展[J];中国奶牛;2007年08期

10 周兴;张居农;;精子载体转基因技术研究进展[J];吉林农业科学;2008年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 桂耀庭;唐爱发;余振东;张立兵;张键荣;李贤新;蔡志明;;精子发生相关基因的筛选和功能研究[A];中国生理学会2007年消化内分泌生殖学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

2 王晖;徐珉;李建民;肖俊华;许志洋;周作民;沙家豪;;人精子发生相关基因精子表达谱系的建立及初步临床应用[A];第九次全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2003年

3 王晖;周作民;徐珉;李建民;沙家豪;;人精子中精子发生相关基因谱系的构建及初步临床应用[A];江苏省遗传学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年

4 高永金;金保方;;精子DNA完整性损伤及其相关性研究进展[A];2011·中国医师协会中西医结合医师大会论文集[C];2011年

5 高永金;金保方;;精子DNA完整性损伤及其相关性研究进展[A];中华中医药学会第十一届男科学术大会论文集[C];2011年

6 张美佳;洪海燕;周波;金世英;王超;傅茂勇;王松波;夏国良;;心钠肽在猪输卵管中的表达以及其对精子功能的影响[A];第十届全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2005年

7 孙中明;;精子超微结构与男性不育[A];浙江省中医药学会2005年男科中医、中西医结合学术交流会资料汇编[C];2005年

8 贾孟春;;精子发生及其激素调节[A];第二届全国不育症研讨会论文汇编[C];2007年

9 桂耀庭;唐爱发;余振东;张立兵;张键荣;李贤新;蔡志明;;精子发生相关基因的筛选和功能研究[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年

10 张立营;曾梅;孙华钦;陈朴;张思仲;马用信;;小鼠T-STAR蛋白靶mRNAs的分离及鉴定[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 上海交通大学医学院附属仁济医院上海市人类精子库 杜宏伟　上海市男科学研究所 李铮;人体最激情的舞者——精子[N];东方早报;2011年

2 记者 刘泽林;“准精子”在猴类体外培育成功[N];健康报;2013年

3 本报记者 董毅然;精子危机会让人类断子绝孙吗[N];北京科技报;2004年

4 河北农大动科院 王立泽 王建涛 张国宾;给狐采精勿弃精清[N];河北科技报;2007年

5 刘长亮;“附睾炎致不孕”内幕揭秘[N];农村医药报（汉）;2008年

6 汪文;做个准爸爸，你准备好了吗？[N];江苏科技报;2000年

7 段恩奎;人造精子用于临床不能过于乐观[N];科技日报;2006年

8 刘远桥邋邹争春;为准爸爸开具营养处方[N];科技日报;2007年

9 潘文;对人工精子的临床前景不能过于乐观[N];中国医药报;2006年

10 黄力;准爸爸要早做准备[N];保健时报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 侯聪聪;十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究[D];浙江大学;2015年

2 张顺;单精子胞质内注射转基因法（ICSI-MGT）生产转Fat-1基因兔的初步研究[D];广西大学;2013年

3 库尔班·吐拉克;塔里木马鹿（Cervus elaphus yarkandensis）精子体外获能及其相关蛋白酪氨酸磷酸化研究[D];东北林业大学;2015年

4 訾振振;Ccnyl1在精子发生过程中的功能研究[D];中国科学技术大学;2015年

5 张浩波;精子凋亡与男性不育相关系列研究[D];山东大学;2007年

6 李纯锦;牛和人精子中脑源性神经营养因子和神经生长因子的表达及功能研究[D];吉林大学;2010年

7 朱复希;圆头精子症受精失败机理、对策及其基因诊断平台的建立[D];中南大学;2013年

8 崔险峰;非梗阻性无精子症睾丸外科取精及睾丸精子冷冻保存的研究[D];天津医科大学;2013年

9 周涛;人与猕猴精子发生相关蛋白质组的生物信息学研究[D];南京医科大学;2014年

10 李峰;精子介导的人凝血因子Ⅸ转基因绵羊技术研究[D];复旦大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 马媛媛;绵羊Spesp1的cDNA克隆以及与其他精卵融合相关精子蛋白的相互作用[D];内蒙古大学;2015年

2 王海玲;莠去津对河蟹精子酶活性、DNA完整性及组蛋白表达的影响[D];河北大学;2015年

3 丹彤;绵羊Izumo2的cDNA克隆、在睾丸和精子上的定位观察及与其它精卵融合相关蛋白相互作用的初步筛选[D];内蒙古大学;2015年

4 田宇;低温处理对猪精子泛素化水平及体外受精的影响[D];延边大学;2015年

5 杨向yN;冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化及结构影响的研究[D];北京协和医学院;2015年

6 朱振东;褪黑色素对兔精子冷冻保存效果的影响[D];西北农林科技大学;2015年

7 陈鹏;小鼠精干细胞系和睾丸ECM体外3D培养体系的建立[D];内蒙古大学;2015年

8 范楚宁;半胱氨酸对獭兔精液冷冻保存效果的影响[D];西北农林科技大学;2015年

9 张妍;易感基因核苷酸多态性对中国汉族男性精子发生障碍的影响[D];安徽医科大学;2015年

10 闫慧;小鼠精子发生过程中dysbindin-1的表达[D];山西医科大学;2015年

，

本文编号：1128186