LGL1基因在小鼠嗅球发育中的功能研究

发布时间：2017-12-07 20:07

  本文关键词：LGL1基因在小鼠嗅球发育中的功能研究

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【摘要】：拟解决的科学问题本试验利用小鼠的条件性基因敲除技术,获得LGL1嗅球特异性敲除小鼠,即Pax2-LGL1条件敲除小鼠。利用这一条件性敲除的小鼠动物模型,我们研究了LGL1基因在嗅球发育过程中的重要生物学功能及对嗅觉信号传导的可能影响机制。拟解决的科学问题为：(1)LGL1在小鼠嗅球发育中的作用；(2)LGL1影响嗅觉信息传导的可能机制； (3)LGL1在调节嗅球神经元迁移和定位的可能分子机制。研究方案及取得的成果本论文为了解决上述科学问题,以小鼠为实验材料,利用Cre-LoxP系统,首先制作了在嗅球中特异性敲除LGL1基因的小鼠模型,由于More-Cre介导的LGL1基因敲除小鼠在出生后24时致死,因此,我们采用Pax2-Cre转基因小鼠在小鼠嗅球中特异性敲除LGL1,所得到的Pax2-LGL1条件敲除小鼠可成功存活至成体。在本论文中,我们利用Pax2-LGL1条件敲除小鼠研究了LGL1基因组嗅球发育过程中的重要作用。Pax2-Cre表达时间较早,大约在胚胎期E7.5天时将LGL1基因在嗅球中特异性敲除。在研究中,我们发现,LGL1基因条件敲除小鼠可以存活到成体,但同野生型小鼠相比,LGL1基因敲除的纯合型小鼠在个体大小和嗅球形态上存在明显的发育异常。Pax2-LGL1条件敲除小鼠体型和嗅球均较小,且存在水肿现象。对野生型和纯合型小鼠的体重跟踪称量发现,与野生型小鼠相比,纯合型小鼠的体重明显减轻。同时,对嗅球背部表面积的测量表明,纯合型小鼠的嗅球表面积明显变小。为了研究LGL1基因敲除对小鼠嗅觉功能的影响,我们分别采用了经典的行为学试验“食物包埋试验”和“嗅迷宫试验”对小鼠的嗅觉功能进行了检测。试验结果表明在“食物包埋试验”和“嗅迷宫试验”中,纯合型小鼠寻找食物所用的时间明显大于野生型小鼠。这也揭示LGL1在小鼠嗅球中的特异性敲除不仅影响了小鼠体型和嗅球形态的正常发育,同时也对小鼠嗅功能的正常发挥产生了重要的影响。小鼠嗅球结构在进化上具有高度保守的层状结构,我们进一步对嗅球的形态结构进行了分析,结果显示,.在野生型小鼠发育过程中,嗅球的层状结构清晰,各层神经元排列稳定有序,而在Pax2-LGL1条件敲除的纯合型小鼠发育过程中,嗅球层状结构模糊,神经元排列紊乱,并在嗅周球细胞层和僧帽状细胞层中出现了层状结构异常以及神经元缺失的现象。因此,我们提出在小鼠嗅球发育的过程中,LGL1基因对小鼠嗅球正常层状结构的形成和稳定,神经元的定位和分布起重要作用。虽然小鼠嗅球结构在进化上具有高度保守的层状结构,但是各层状结构的特征性神经元却并不完全相同,所以可以利用不同的神经元标记分子对嗅球中各层中的特征性神经元进行标记、观察。我们首先研究了LGL1基因缺失对SP8标记的中间神经元的影响。转录因子SP8是SP1锌指蛋白家族成员,在小鼠嗅球的多巴胺能/非多巴胺能和钙网膜蛋白中间神经元都能够表达。SP8的免疫荧光标记结果显示,在成熟的小鼠嗅球中,野生型小鼠嗅周球细胞层中SP8阳性中间神经元排列紧密有序,但在Pax2-LGL1条件敲除的纯合型小鼠中,SP8阳性中间神经元排列紊乱甚至缺失。然而进一步的Western blotting结果显示,LGL1条件敲除的纯合型小鼠中嗅球中SP8的表达水平并没有出现明显的下降。这一结果说明,LGL1缺失可能并没有导致嗅球中SP8阳性中间神经元数量的明显下降,但在引导SP8阳性中间神经元的定位和分布中起重要作用。接下来我们对中间神经元的亚型钙结合蛋白中间神经元进行了检测。通过Calbidin D28k的免疫荧光染色显示,同野生型小鼠相比,纯合型小鼠钙结合蛋白阳性中间神经元层明显变窄,排列紊乱并且数目减少,表达水平降低。嗅球僧帽状细胞是调控嗅觉信号向大脑传导的刺激和选择特异性的重要神经元,同时也是副嗅球(accessory olfactory bulb, AOB)的主要功能性神经元之一。在试验中我们研究了Tbx21标记的位于僧帽状细胞层的特征性纹状神经元僧帽细胞(mitral cells, MCs)。通过Tbx21的免疫荧光检测发现,在小鼠嗅球发育过程中,相比于野生型小鼠的嗅球,纯合型小鼠嗅球的僧帽状细胞层宽度明显变小,其中的MCs纹状神经元随着嗅球的发育成熟,逐渐变少,排列紊乱。并且对AOB的检测发现,纯合型小鼠的AOB明显变小,MCs纹状神经元数目同样明显减少。本课题中我们主要研究了在LGL1在嗅球小鼠嗅球形成和发育过程中,对其发育调控的重要功能及可能的分子机制。嗅球是生物体认知的重要功能性器官,也是神经系统的重要组成部分,参与更高水平的功能,包括情感,种群信息交流以及运动协调等能力。在本论文中,我们首先采用了经典的嗅觉检测的行为学实验,包括食物包埋试验和嗅迷宫试验,检测了Pax2-LGL1条件敲除小鼠的嗅觉变化情况。结果显示Pax2-LGL1条件敲除小鼠的寻找食物能力明显下降。与成熟的野生型小鼠嗅球相比,Pax2-LGL1条件敲除小鼠的体型和嗅球明显减小,并出现了轻微的水肿现象,嗅球中的中间神经元和纹状神经元的发育明显出现异常,神经元分布紊乱,表达水平降低。研究意义本论文利用LGL1特异性敲除小鼠模型,阐明了LGL1基因在小鼠嗅球形成和发育过程中的重要功能,从细胞水平和分子水平上揭示了LGL1调节嗅球发育和神经元迁移的可能机制,为进一步研究高等动物的神经系统发育提供了理论基础。此外,神经系统退行性疾病,尤其AD随着社会人口老龄化程度的加剧,越来越常见,并且在医学领域还没有找到真正的病因和治愈方法。由于嗅觉障碍被发现作为AD患者初期的临床主要症状之一,因此,对嗅球发育及嗅觉信号传导的研究能够在一定程度上推动了诸如AD等神经性疾病临床诊断治疗的发展。本研究制作的Pax2-LGL1条件敲除小鼠可以存活至成体,并作为理想的人类疾病的动物模型,不仅为临床诊断和治疗提供理论基础,同样可以为高等动物认知障碍和嗅觉相关疾病的治疗提供新的思路,具有一定的指导意义。我们可以从神经性疾病患者中,特别是AD病人中检测是否存在LGL1基因的突变,可能为以后药物靶向位点的设计和神经相关性疾病的治疗提供理论基础。因此,我们的研究成果不仅为嗅球发育的基础研究填补了一定的空白,同时也在一定程度上推动了嗅功能障碍及相关的神经性疾病临床诊断治疗的发展。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：1263597