体内硝酸盐、亚硝酸盐分析新方法及其应用研究

发布时间：2017-12-09 02:24

  本文关键词：体内硝酸盐、亚硝酸盐分析新方法及其应用研究

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【摘要】：一氧化氮(NO)是机体内作用广泛、性质独特的信号分子,也是一种新型的细胞间信息交换的重要载体。近年来,有关NO的生物学和病理学效应的研究得到了迅速发展,已成为生物医学领域研究的热点和前沿之一。NO作为一种新型的信使分子参与体内多种主要生理功能,但它的生成过多或合成不足,却是人类许多疾病的病因或主要促进因素。体内NO浓度已经成为衡量人体健康与疾病状态的重要指标之一,因此生物体内NO的检测方法的研究及其应用在临床上具有重要意义。但由于NO化学性质非常活泼,在体内的半衰期仅为3-5s,极易被氧化,直接测定难度较大。体内硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)作为相对稳定的NO代谢产物,引起越来越多的关注,大量研究表明可通过测定体液中的NO3-、NO2-的含量来间接反映体内NO水平。然而由于生物样品基质复杂多样,且生物体内NO2-含量仅为ng水平,远远低于NO3-含量,检测难度高于NO3-。因此针对目前生物样品中NO3-、NO2-分析检测存在的问题,建立新型检测技术和样品前处理技术显得非常重要。采用建立的灵敏、高效的分析方法,研究在海拔及不同因素影响下生物体内NO3-、NO2-的变化,为高原反应评估奠定基础;为探讨体内NO3-、NO2-在高原低氧适应中的可能机制提供依据。本论文主要研究内容如下:(1)采用反相离子对高效液相色谱法同时测定血液、尿液中亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)。在弱酸性流动相中离子对试剂四丁基氢氧化铵(TBAOH)与NO3-形成离子对,检测波长为230 nm;NO2-通过重氮化偶合反应生成偶氮化合物,检测波长为510 nm。由于两种产物极性差异较大,避免了相互干扰。因此采用双波长检测方法,在相同的色谱条件下同时测定两种离子。在优化的实验条件下,NO3-和NO2-通过AgilentTC-C18色谱柱在12min内得到完全分离。消除了生物样品中常见离子和溶解性有机物对测定干扰的同时,提高了 NO2-的检测灵敏度。在最佳条件下,NO3-和NO2-分别在5-200μg/mL和10-1000ng/mL浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系,检测限分别为0.5 μg/mL和4.5 ng/mL,相对标准偏差为2.8-4.9%。该方法适用于生物样品中NO3-和NO2-的同时测定,并具有较高的检测灵敏度和精密度。(2)采用浊点萃取技术血浆和尿液中亚硝酸盐(NO2-)衍生物进行萃取,萃取物通过酶标仪分光光度法进行测定。该方法采用活性炭进行尿液脱色,用硫酸锌和氢氧化钠对血浆进行蛋白沉淀及脱色处理,去除样品基体干扰。以非离子表面活性剂Triton X-114作为萃取剂,萃取样品中NO2-偶氮化合物,用酶标仪代替紫外可见分光光度计,多个样品可被同时测定。最优萃取条件为4%(v/v)Triton又-114,0.2g(NH4)2SO4,3000rpm离心8min。在优化的实验条件下,NO2-在10-1000 ng/mL浓度范围内与吸光值呈现良好的线性关系,检出限为2.5 ng/mL,回收率为90.5～95.9%,富集倍数可达24.5倍。与紫外可见分光光度法相比,酶标法操作更为简便,表面活性剂富集相无须稀释脱盐处理,可在十几秒内完成数十个待测样品的测定,具有明显的优势。(3)采用分子荧光光谱法研究了亚硝酸盐(NO2-)与邻苯二胺(OPD)的衍生化反应及形成的衍生物苯并三氮唑的荧光强度变化,应用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合苯并三氮唑,结合双水相萃取技术萃取NO2--OPD-HP-β-CD衍生包合物。建立了 OPD衍生化-HP-β-CD包合-双水相萃取-分子荧光光谱法检测尿液中NO2-的分析新方法。在优化的条件下,NO2-浓度在10-400 ng/mL范围内与荧光强度呈现良好的线性关系,检出限为0.5 ng/mL。方法的加标回收率在89.1-93.7%之间,相对标准偏差小于6.2%。研究了 NO2-与OPD衍生化反应的机理,测定了 HP-β-CD分子包合NO2--OPD衍生物的包合比、包合常数。(4)采用正辛醇作为萃取剂,阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为分散剂,对血浆和尿液中的NO2-衍生物进行分离富集,结合酶标仪分光光度法进行测定。在最佳条件下,样品中NO2-的浓度在10-800 ng/mL范围内与其吸光度呈现良好的线性关系,检出限为2.1 ng/mL,回收率高于90.1%,相对标准偏差RSD低于4.7%。该方法利用表面活性剂既有疏水基团又有亲水基团的特性,替代甲醇、乙腈、丙酮等有机分散剂,使萃取剂向液体样本中快速分散,体系充分混合,增大了萃取剂与目标分析物的接触几率,从而提高萃取效率。(5)本研究结合前四章的样品前处理方法完成了新型NO3-和NO2-快速检测试剂盒的初步构建。试剂盒的成功研制不仅具有廉价优势,还保证了检测的重复性、精密度及灵敏度,具有一定的市场前景。在检测方式上结合酶标仪分光光度法,更能充分发挥其简单快速的优势。使用96孔酶标板进行测定满足了临床研究及科研检测样本量大的需求,旨在为临床NO的研究提供快速、准确的分析检测手段。(6)以长年生活在平原和急进高原后的健康人群作为研究对象,采用第五章研究的NO3-和NO2-快速检测试剂盒与酶标仪分析法相结合,测定其血浆中NO3-和NO2-的含量,主要分析体内NO3-/NO2-水平与海拔高度的相关性。应用多重线性回归、SPSS等相关统计方法对数据进行处理。结果表明,平原人急进高原后,血浆中NO2-水平略低于平原水平,与海拔的相关性更强。并随海拔高度的升高而降低,实验结果大致与以往研究结果相近。因此检测血浆中NO3-/NO2-的含量,对于高原反应发病机理研究和急进高原反应前的防治具有一定的指导作用。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R339.5

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