小分子化合物对RecQ解旋酶家族成员活性影响的研究

发布时间：2017-12-11 19:29

  本文关键词：小分子化合物对RecQ解旋酶家族成员活性影响的研究

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【摘要】：解旋酶可以利用核苷三磷酸水解过程所释放出的能量来沿着核酸链进行移动,进而完成解开核酸双链并使其分离的整个反应。作为解旋酶的代表,RecQ解旋酶家族是一类能够在维护染色体基因组和端粒稳定性方面发挥巨大作用的蛋白因子。更为重要的是,在人类中该家族成员(BLM,WRN和RECQ4)的遗传突变会形成三种严重的疾病,分别是Bloom,Werner和Rothmund-Thomson综合症,而这些疾病又会伴随着较高癌症风险的发生。此外,该家族的另一个成员,RECQL解旋酶,可能会与乳腺癌和胰腺癌的发生之间存在关联。在解旋酶发挥生理作用的时候,某些小分子化合物可以起到调节或是影响解旋酶活性的作用,如三磷酸腺苷可以通过调节蛋白的聚集体状态从而影响其对核酸底物的解旋能力。另外,某些重金属化合物也可能会对解旋酶的活性造成潜在影响,例如氯化镉的摄入或是BLM蛋白的缺失都会导致相同的姐妹染色单体交换增加的细胞学现象,这就暗示了镉和BLM之间可能存在某种相互联系。所以,为了明确小分子对解旋酶活性的影响,本次实验选取了两组研究对象,即RECQL和三磷酸腺苷,以及BLM和氯化镉,之后详细分析了各自之间的依赖关系以及由此产生的解旋酶活力的变化。实验中,首先利用了原核表达系统并经亲和,离子交换或凝胶过滤层析纯化技术获得了高纯度的蛋白样品,之后再使用动态光散射分析,荧光各向异性测定,荧光共振能量转移结合停流光谱技术等手段研究了小分子对解旋酶诸多方面的影响,其中包括了聚集体状态,DNA底物结合和解旋活性等方面,希望借此以丰富人们对于解旋酶的整体认知。三磷酸腺苷影响RECQL活性的实验结果表明:(1)自然状态下的RECQL是以四聚体的形式存在。但是,当蛋白与ATP结合之后,则会迅速解离为稳定存在的二聚体形态,即ATP是调节RECQL组装形式的开关。另外,RECQL突变体蛋白,RECQL49-616和RECQLWH-AAA,则分别呈现为均一的二聚体和单体状态并且不能被加入的ATP所改变;(2)不同聚集体形式的蛋白与DNA结合时的亲和力也不同。其中,四聚体的RECQL和二聚体的RECQL49-616分别对平齐的双链DNA和单链DNA亲和力最高。此外,在结合G4 DNA时,RECQL明显依赖于其3’端存在的单链DNA尾巴;(3)受ATP影响的不同形式的蛋白组装状态对应了不同的活性,其中,四聚体蛋白负责退火而二聚体起到解旋的作用;(4)利用多转换下变化3’端单链DNA长度,稳态解旋分析以及改变ATP浓度引起的解旋变化等动力学实验,证明了RECQL是以一种均一稳定的二聚体形态参与解旋过程的;(5)不同聚集体状态的蛋白在解旋时存在底物偏好性,其中RECQL解旋Holliday连接体的能力较强,而RECQL49-616更倾向于处理双链DNA结构;(6)首次发现RECQL能够解旋G4类型DNA底物,而RECQL49-616有微弱地解旋Holliday连接体的能力。本次研究第一次成功地使用了大肠杆菌表达系统并结合蛋白纯化技术获得了质量较好的牛RECQL解旋酶,并且首次利用停流-FRET技术对该酶的活性加以分析,最终明确了ATP在RECQL聚集体形态和活性变化中所起的调控作用,同时也证明了该蛋白在解旋时的工作状态应该是二聚体形式。这些发现为深入阐明RECQL的工作机理奠定了重要基础。镉影响BLM活性的实验结果表明:(1)镉可以造成BLM解旋和ATP酶活力的严重丧失;(2)BLM上存在有两种对镉亲和力不同的半胱氨酸残基类群;(3)镉能够强烈抑制BLM的DNA结合能力,而这种影响是通过镉与蛋白表面半胱氨酸的巯基基团相结合来实现的;(4)与现有报道不同的是,在BLM结合活性受到抑制的过程中,蛋白的锌指结构域可能只起到了微弱的作用;(5)镉会使BLM单体蛋白形成明显的聚集体复合物,而EDTA可以逆转这种效应;(6)二硫苏糖醇是镉抑制蛋白结合活性所必需的,并且其浓度变化会对此抑制过程造成不同的影响,而EDTA同样会抵消这种抑制效应;(7)镉对BLM的DNA解旋活性的阻碍作用不能被EDTA所逆转。本次研究为理解镉所引起的不依赖于锌指结构域的BLM失活现象的机理提供了新的有力线索,同时也为实现全面认识BLM在同源重组修复以及维持基因组稳定性方面所扮演的角色这一目标提供了重要信息。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55
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本文编号：1279681