长叶红砂黄酮类化合物合成相关基因功能分析及其对逆境胁迫的响应

发布时间：2017-12-11 20:16

  本文关键词：长叶红砂黄酮类化合物合成相关基因功能分析及其对逆境胁迫的响应

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【摘要】：植物通过积累多种小分子次生代谢产物,保护其抵抗不同的生物及非生物胁迫。在这些小分子化合物中,黄酮类化合物由于普遍存在性和化学结构多样性,在多种植物中得到广泛的研究。但研究都主要集中在模式植物和农作物中,对野生抗逆植物的研究却十分少见。强旱生泌盐盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)是我国东阿拉善-西鄂尔多斯特有野生植物,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性。是研究次生代谢产物响应植物抗逆机制的良好材料。本论文在对长叶红砂盐胁迫前后转录组测序结果分析的基础上,筛选出9个长叶红砂黄酮醇合成途径中的差异表达基因(Differentially Expressed Gene, DEG,|log2Ratio|≥1)。分析他们在UV-B和盐胁迫前后的表达量变化,对长叶红砂黄酮合成基因进行初步抗逆功能验证。通过高效液相色谱及质谱分析初步鉴定长叶红砂黄酮类化合物成分,比较UV-B和盐胁迫前后黄酮类化合物成分的变化,发现黄酮类化合物在植物抵抗非生物胁迫中的作用。克隆黄酮类合成关键酶原花青素双加氧酶基因RtLDOX和苯丙氨酸裂解酶基因RtPAL1,分析这两个基因的序列信息、系统进化、表达水平及其酶的催化活性。转化拟南芥突变体,鉴定RtLDOX生理调节功能及抗盐胁迫能力,探讨其在拟南芥中的催化能力及抵抗非生物胁迫过程中发挥的作用。主要研究结果如下：1.对长叶红砂盐胁迫前后转录组数据库中黄酮类化合物合成相关基因及转录因子进行生物信息学分析,发现118条unigenes可能参与异黄酮、黄酮醇和花青素三种黄酮类化合物合成途径。其中47条unigenes与黄酮醇合成相关,这些黄酮醇合成相关基因在盐胁迫后70%都显著上调表达。从转录组数据库中筛选665条unigenes被注释编码长叶红砂MYB、WD40、bHLH和WRKY四个转录因子家族成员,从中发现13条unigenes可能调控黄酮类化合物合成途径。2.筛选出9个黄酮醇合成关键酶基因RtC4H、RtCHS、RtF3H3、RtFLS1、 RtFLS2、RtF3'5'H、RtF3'H、RtOMT和RtMYBF1,定量RT-PCR (quantitative RT-PCR, qPCR)分析显示这9个基因在不同程度UV-B照射和盐处理后基因表达量显著升高,同时伴随着长叶红砂总黄酮醇及其抗氧化能力的增加。DPPH分析显示长叶红砂黄酮类化合物具有极强的抗氧化能力,比模式植物拟南芥的抗氧化能力高出7.25倍。UPLC-QQQ-MS分析检测发现四种黄酮醇成分芦丁,异鼠李-3-新橙皮苷、金丝桃苷和杨梅素在UV-B和NaCl处理后含量显著升高。3.利用RT-PCR和RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆黄酮类化合物合成关键酶基因RtLDOX的cDNA全长序列,该基因长1441b p,编码362个氨基酸。分析RtLDOX基因的启动子序列,发现其中含有W-box、MYB和LTRE等逆境胁迫响应元件。RtLDOX表达分析结果显示,短时间干旱、高盐、UV-B及低温处理都能诱导RtLDOX基因表达量升高,特别在盐处理后其表达量显著升高,约为对照的25倍。将RtLDOX在大肠杆菌中功能表达,获得与预期大小一致的His-RtLDOX重组蛋白。通过His标签纯化RtLDOX重组蛋白,用其催化柚皮素、二氢杨梅素和二氢槲皮素,发现RtLDOX具有F3H酶催化活性,能催化柚皮素生成二氢山奈酚,但对其他两种底物没有催化能力。4.RtLDOX转化拟南芥LDOX突变体(transparent testa 11-11,tt11-11),获得稳定遗传的RtLDOX阳性转化植株。分析阳性转化植株发现,该基因能互补拟南芥LDOX突变体种子恢复合成花青素和原花青素,使种子颜色几乎恢复正常水平。在盐胁迫下,发现RtLDOX转基因植株比tt11-11和野生型(Wild-type,WT)具有更高的生物量和黄酮类化合物含量。通过检测黄酮类化合物对自由基DPPH清除能力,发现盐胁迫能增强RtLDOX转基因植株的抗氧化能力。由此可见,RtLDOX能够通过增加植物次生代谢产物黄酮类化合物含量,增强植物抗氧化能力,提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。5.在UV-B照射后,发现长叶红砂黄酮类化合物合成关键酶RtPAL酶活性显著增加,24 h胁迫后酶活性约为对照组的2.5倍。分析长叶红砂RtPALs基因家族成员RtPAL1、RtPAL2和RtPAL3在UV-B胁迫后的表达水平,结果显示RtPAL2和RtPAL3在胁迫后的表达水平并没有显著变化,而RtPAL1在UV-B胁迫后表达量增加,显著高于对照水平,推测RtPAL1可能是RtPAL酶活性在UV-B胁迫下增加的关键调节基因,在植物抵抗紫外胁迫过程中发挥着重要作用。克隆获得RtPAL1基因序列2055 bp,编码684个氨基酸；构建RtPALl植物表达载体pPZP221-RtPAL1,将其转化农杆菌,为随后RtPAL1基因抗逆功能鉴定奠定基础。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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本文编号：1279776