亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化细菌培养条件优化及其生态功能

发布时间：2017-12-12 16:31

  本文关键词：亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化细菌培养条件优化及其生态功能

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【摘要】：微生物催化的亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化(N-DAMO)耦合了甲烷厌氧氧化和亚硝酸盐还原两个过程,是全球碳氮循环中的重要一环,也是潜在的废水生物脱氮工艺。然而,N-DAMO细菌生长极其缓慢,倍增期长达几周至几个月。这导致N-DAMO富集物难以获得,严重制约N-DAMO过程的进一步科学研究和工程应用。尽管N-DAMO细菌分布广泛,但在很多生境中丰度较低,原有PCR引物灵敏度较差,难以检测一些环境中低丰度的N-DAMO细菌。本论文通过短期活性试验和长期培养试验,优化了N-DAMO细菌培养的环境条件和营养条件,并将优化结果应用于N-DAMO细菌的后续培养;从富集物中获得了N-DAMO新种,并参考新种序列优化了NC10门特异性引物;借助新引物以及其他检测手段,探明了N-DAMO细菌在滨海湿地系统中的生态功能。主要研究结果如下:1)研究了温度、pH和盐度等环境条件对N-DAMO细菌代谢活性和生长速率的影响,获得了最佳环境条件。短期活性试验结果表明,温度、pH和盐度对N-DAMO细菌的代谢活性具有显著影响。温度低于35℃时,N-DAMO比活性随着温度的增加而指数上升,温度高于35℃时,随着温度的增加而急剧下降,两者之间的相互关系可由扩展的阿伦尼乌斯方程描述,最佳温度约为35℃。在pH测试范围内(6.0～9.0),N-DAMO比活性随着pH的增加先增加,后降低,两者之间的相互关系可由修正的安东尼奥方程描述,最优pH约为7.6。高盐度可抑制淡水N-DAMO细菌的活性,20 g NaCl·L-1盐度下几乎检测不到N-DAMO活性。长期培养试验表明,温度、pH和盐度对N-DAMO细菌的生长也有影响,最佳培养条件为温度35℃、pH7.6以及盐度0g NaCl·L-1。特别值得注意的是,在20g NaCl·L-1盐度下,培养初期富集物并不具有N-DAMO活性,但经过90d培养后,富集物中检测到了明显的N-DAMO活性,甲烷消耗速率达0.029μmol CH4·h-1。NC10门16S rRNA和pmoA基因序列系统发育分析显示,90d培养前后,N-DAMO细菌群落结构并未发生明显变化,说明富集物N-DAMO活性的恢复,是由于原有N-DAMO细菌的盐度适应,而非新的嗜盐N-DAMO细菌的生长繁殖。据我们所知,这是首次发现N-DAMO细菌的盐度适应现象。2)研究了铁、铜、锌、钼、钴、锰和镍等微量元素对N-DAMO细菌代谢活性和生长速率的影响,获得了最佳配比,并应用于N-DAMO细菌的后续培养。短期活性试验表明,亚铁离子和铜离子对N-DAMO活性具有较明显的影响。在4～100μmol·L-1范围内,随着亚铁离子浓度增加,N-DAMO活性先明显增加,后略有回落,在20μmol·L-1附近,获得最大值。在测试范围(1～100μmol·L-1)内,随着铜离子浓度增加,N-DAMO活性先略有增加、后明显下降,在10μmol·L-1附近,获得最大值。高浓度铜离子(25～100μmol·L-1)对N-DAMO细菌具有明显的抑制作用。在测试范围内,培养基中锌、钼、钴、锰和镍等元素对N-DAMO细菌没有显著影响。长期培养试验表明,亚铁离子和铜离子对N-DAMO细菌具有明显影响,在测试范围(亚铁离子4～20μmol·L-1,铜离子1～10μmol·L-1)内,增加亚铁离子或铜离子浓度,可促进N-DAMO细菌的生长。在测试范围内,锌、钼、钴、锰和镍等微量元素对N-DAMO细菌的长期影响小于试验随机误差。因此,改良后的培养基中,亚铁离子浓度提高至20μmol·L-1,铜离子浓度提高至10μmol·L-1,其他元素浓度保持不变。将改良后的培养基应用于N-DAMO反应器中,发现应用改良培养基后,N-DAMO细菌的生长速率明显加快,富集培养速度提高至原来的2～3倍。特别是,应用改良培养基后,N-DAMO细菌形成大而密实的团聚体。比较单个团聚体包含的细胞个数和培养前后N-DAMO细菌数量的增加倍数,发现这些团聚体的成因主要是许多细胞的相互粘附,而非单个细胞的生长繁殖。3)获得了N-DAMO新种,并参考新种序列,优化了NC10门特异性引物,获得了灵敏度更高的PCR检测方案。采用细菌通用引物8F/1492R,扩增获得了N-DAMO新种16S rRNA基因的全长序列。根据NCBI数据库,发现该新种广泛分布于中国生境中,可能有着重要的生态意义。针对常用NC10门特异性引物存在的缺陷,优化了PCR引物。原有引物202F在错误的碱基位552～563处具有强结合,存在严重非特异性扩增;原有引物qP1F与新种序列在3'端存在碱基错配。本文设计了新引物1051F,并在引物qP1F中引入简并碱基(R),用以消除碱基错配可能带来的影响。建立了用于NC10细菌16S rRNA基因扩增的新巢氏PCR方案。新方案对NC10细菌具有很强的特异性,并且具有很高的灵敏度。新方案的检测限约为103 copies·g-1干重,而原方案仅为105 copies·g-1干重。此外,在定量PCR引物qP1F中引入简并碱基,获得了更高的NC10细菌丰度,并且NC10细菌丰度与样品N-DAMO活性之间具有更好的相关性。4)结合分子生物学手段和稳定同位素示踪技术,探明了N-DAMO细菌在滨海湿地系统中的生态功能。探明了滨海湿地沉积物中甲烷和各类电子受体的垂直分布特征。深层沉积物(3 cm)含有较高浓度的甲烷(最高达32μmol·L-1),表层沉积物(0～0.5 cm)甲烷含量较低(0.3μmol·L-1)。氧气在沉积物中的渗透深度不足1cm,硝酸盐/亚硝酸盐的渗透深度为2～4 cm,硫酸盐贯穿整个被试沉积物。在次表层沉积物中,甲烷与硝酸盐/亚硝酸盐相遇,该区域易发生N-DAMO过程。探明了滨海湿地沉积物产甲烷和甲烷氧化速率随深度变化的规律。表层和深层沉积物检测到甲烷净产生,次表层沉积物(0.5～2 cm)存在明显的甲烷净消耗。甲烷好氧氧化、DAMO(包括N-DAMO和nitrate-AOM)和硫酸盐型甲烷厌氧氧化过程分别主要发生于表层、次表层和深层沉积物中,活性分别为0.5～1.6、1.4～3.2和0.7～3.0 nmol CH4·day-1·mL-1湿泥。探明了滨海湿地沉积物中甲烷氧化微生物的菌群结构特征。沉积物中甲烷氧化微生物具有明显的分层分布特征:MOB主要存在于表层沉积物中;DAMO微生物(包括N-DAMO细菌和DAMO古菌)主要存在于次表层沉积物中,隶属于NC10门的N-DAMO细菌是主要的DAMO微生物;ANME主要存在于深层沉积物中。定量PCR结果也表明,N-DAMO细菌主要存在于次表层。该项研究表明,N-DAMO过程是被试滨海湿地重要的沉积物甲烷汇,贡献率为23～58%。特别是,N-DAMO细菌的存在使得整个被试滨海湿地成为大气甲烷汇,甲烷氧化速率为0.10～0.18 nmol CH4·day-1·cm-2。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;X703

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本文编号：1283185