嗜热真菌第3家族β-葡萄糖苷酶的多样性和分子改造

发布时间：2017-12-13 17:31

  本文关键词：嗜热真菌第3家族β-葡萄糖苷酶的多样性和分子改造

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【摘要】：β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是降解自然界中纤维物质的关键限速酶,并且对于多种生物活性物质具有转化能力,在生物能源、食品保健和饲料行业都有广阔的应用前景。微生物来源的β-葡萄糖苷酶是非常重要的生物酶资源,对于微生物来源的β-葡萄糖苷酶的挖掘和新型β-葡萄糖苷酶的开发具有重要可持续发展意义。本研究以嗜热真菌特异腐质霉(Humicola insolens Y1 GCMCC 4573)和篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM 12802)为材料,系统研究了第3家族β-葡萄糖苷酶的生化性质、功能多样性、底物结合关键氨基酸以及催化效率相关关键氨基酸,并成功对部分β-葡萄糖苷酶进行了分子改造。主要结果如下：(1)嗜热真菌特异腐质霉(H.insolens Y1 GCMCC 4573)第3家族β-葡萄糖苷酶多样性和底物结合研究首次克隆了3个特异腐质霉(H.insolens Y1)来源的第3家族β-葡萄糖苷酶基因,并将其在毕赤酵母中成功表达。分析表明,它们在序列上分属于不同遗传进化分支,在功能上也表现出一定的多样性。3个重组酶都表现出高温中性(50-60℃,pH 5.5-6.0)和葡萄糖耐受性好的特点,但底物特异性差异较大。HiBg13A和HiBg13C具有广泛的底物特异性,对二糖底物和芳香基糖苷底物具有较好的水解能力,而HiBg13B仅对芳香基糖苷底物具有水解活性。3个重组酶中HiBg13C表现出最高的比活力(对pNPG 158.8 U/mg,对纤维二糖56.4 U/mmg)和催化效率(对pNPG 1557/s/mM,对纤维二糖23.0/s/mM),且能够很好地协同纤维素酶促进纤维素降解,具有很好的应用价值。此外,HiBg13B的Ile48、Ile278和Thr484与HiBg13A中对于氨基酸为点进行替换的突变体组合突变体获得了对槐糖的水解活性,而对应的HiBg13A的替换突变体严重失活。该项研究揭示了第3家族β-葡萄糖苷酶的序列多样性与功能多样性之间的关系,证明了与底物+1位配体单元结合的关键氨基酸位点。(2)嗜热真菌篮状菌(T. leycettanus JCM12802)第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13ApH稳定性改造首次克隆了篮状菌(T. leycettanus)第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13A,并在毕赤酵母中成功表达。纯化后的重组Bg13A表现出优异的酶学特性,最适反应温度为75℃,最适pH为4.5,且具有良好的热稳定性,在60℃保持稳定。重组工程菌在3L发酵罐中发酵培养时,粗酶液酶活高达6000U/ml。Bg13A催化性能突出,对pNPG比活力为905 U/mg,催化效率kcat/Km值为9096/s/mM,对纤维二糖比活力为265.5U/mg,催化效率kcat/Km值为75.8/s/mM。其缺陷在于pH稳定性极差。本研究通过构建去除潜在的O-糖基化修饰位点的突变体证明了该酶在毕赤酵母中重组表达时发生过度的O-糖基化修饰,导致其pH稳定性极差。两个突变体均表现出大大改善的pH稳定性,能够在pH 3.0-10.0保持稳定。由于其稳定性的提高,突变体M1在酶解糖化试验中表现优于野生型Bg13A。在添加相同酶活单位的条件下,突变体M1与纤维素酶Celluclast 1.5L的协同效果与商业化β-葡萄糖苷酶Novozyme 188相当,表现出巨大的应用潜力。(3)嗜热真菌篮状菌(T. leycettanus JCM12802)第3家族β-葡萄糖苷酶Bgl3A对纤维二糖催化效率的改造篮状菌(T. leycettanus)第3家族p-葡萄糖苷酶Bg13A因其突出的酶学性质而具有巨大的开发价值。实验数据显示Bg13A对纤维二糖的催化效率远低于对pNPG的催化效率,其主要原因是Bg13A对纤维二糖底物的亲和力较低。为了针对其催化效率进行分子改造,通过蛋白质结构分析和分子对接分析找出了多个与酶催化紧密相关的关键氨基酸残基。进而,通过对催化口袋附近稳定疏水区域的破坏,突变体M36E和M36N相比野生型Bg13A对纤维二糖的Km分别降低为5.0mM和4.7mM,催化效率均提高约2.3倍；通过对氢键网络关键氨基酸残基Arg65和Arg167成键能力的增强,突变体F66Y和E168Q相比野生型Bg13A对纤维二糖的亲和力分别提高2.4倍和2倍,催化效率分别提高1.6和1.4倍。分子动力学模拟结果表明,M36E和M36N主要通过增强疏水结合位点Phe258的柔性,提高其对纤维二糖底物的捕获概率来提高酶对二糖底物的亲和力,进而提高催化效率；F66Y和E168Q则主要通过增强Arg65-Phe67和Arg167-Tyr202之间形成的阳离子-π相互作用使催化口袋氢键网络关键氨基酸残基Arg65和Arg167的成键能力增强,提高酶对底物的亲和力,进而提高催化效率。结合能计算结果也表明,所有优势突变体与底物的结合相较野生型Bg13A更为稳定。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936

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