柠条锦鸡儿LEA基因家族成员的鉴定与功能分析

发布时间：2017-12-13 22:12

  本文关键词：柠条锦鸡儿LEA基因家族成员的鉴定与功能分析

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【摘要】：柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)属于豆科锦鸡儿属,分布于我国西北荒漠和半荒漠地区,具有极强的抗逆性和广适性,是一种研究植物抗逆机制的理想材料。胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)在植物抵抗非生物胁迫过程中起着重要作用,但目前对柠条锦鸡儿LEA基因的研究还较少。本研究在柠条锦鸡儿干旱消减抑制杂交文库(SSH)和中间锦鸡儿干旱转录组测序基础上,通过RACE和同源克隆技术对柠条锦鸡儿LEA基因家族成员进行克隆分析,并对其中部分LEA基因在胁迫响应中的功能进行了初步研究,具体结果如下:1.本研究从干旱消减抑制杂交文库(SSH)和干旱转录组测序结果中共鉴定得到26个CkLEA基因,包括3个LEA_1,8个LEA_2,3个LEA_3,2个LEA_4,1个LEA_6,2个SMP和7个dehydrin基因,并对这些基因的特征和系统进化关系进行了分析。2.利用实时荧光定量PCR对CkLEA基因的表达模式进行了检测,大部分CkLEA基因在根、茎、叶、花和种子中的表达都具有一定的组织特异性,并能够受干旱、盐、低温、热、高pH和ABA等处理诱导。3.利用RACE技术克隆得到3个CkLEA基因cDNA序列,命名为:CkLEA2-2、CkLEA2-3、CkLEA4-2,3个基因分别编码了 152、152、320个氨基酸。4.构建了CkLEA2-2-GFP、CkLEA2-3-GFP和CkLEA4-2-GFP三个GFP融合表达载体。亚细胞定位观察发现,CkLEA4-2定位在线粒体上,CkLEA2-2和CkLEA2-3定位于细胞质、细胞核和细胞膜上。5.构建了CkLEA2-2基因原核表达载体pE2-CkLEA2-2,转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化的大肠杆菌进行胁迫处理,发现CkLEA2-2提高了大肠杆菌对盐和渗透胁迫的耐受能力。6.构建了 pCanG-CkLEA2-2、pCanG-CkLEA2-3、pCanG-CkLEA3-1 和pCanG-CkLEA4-2植物过表达载体,对转基因拟南芥功能进行研究。过表达CkLEA2-2、CkLEA2-3、CkLEA3-1、CkLEA4-2均不同程度地提高了拟南芥在NaCl和mannitol胁迫下的萌发率,并降低了种子萌发过程中对ABA的敏感性。在幼苗生长阶段,过表达CkLEA2-2增强了拟南芥对NaCl和ABA的耐受性,主根长于野生型;过表达CkLEA2-3、CkLEA3-1和CkLEA4-2提高了拟南芥的抗旱性,此外,各过表达株系中参与ABA信号途径和胁迫响应基因的表达也出现上调。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

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本文编号：1286766