去甲基化蛋白酶ALKBH5与转录调控蛋白NaID结构和性质的研究

发布时间：2017-12-15 06:13

  本文关键词：去甲基化蛋白酶ALKBH5与转录调控蛋白NaID结构和性质的研究

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【摘要】：蛋白质是细胞的重要组成分子,与生物体中各种生命活动紧密相关。由于蛋白质的氨基酸组成和空间结构千变万化,使得蛋白质具有多种多样的性质与功能。研究蛋白质的结构,并了解其相关的生物活性,对于深入了解生命体中的各种生理活动与生命现象具有重要意义。本论文中,我们利用蛋白晶体学成功得到了斑马鱼中的N6-甲基腺嘌呤(m6A)去甲基化蛋白酶ALKBH5和绿脓杆菌中MexAB-OprM多药耐药外排泵的转录调控蛋白NalD的晶体结构,并依据这两个蛋白的结构对它们的生物活性和功能进行了一系列的生物化学实验。此外,我们还利用蛋白质工程对NalD蛋白的结构进行改造,使改构的蛋白能够识别TetR蛋白结合的DNA序列。ALKBH5蛋白属于二价铁/α-酮戊二酸盐依赖型双加氧酶AlkB蛋白家族。它能催化单链RNA中的m6A发生去甲基化反应,生成腺嘌呤。我们成功获得了斑马鱼ALKBH5蛋白晶体,并解析得到其蛋白结构。通过与另一个m6A去甲基化蛋白酶FTO的结构比对,我们发现ALKBH5蛋白中的氨基酸Lysl00和Pro175可能参与了m6A去甲基化反应。这一结论通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱实验(MALDI-TOF-MS)得到进一步确认。此外,我们在实验中还发现ALKBH5蛋白催化的m6A去甲基化过程与FTO蛋白的催化过程不同：FTO蛋白在催化m6A去甲基化的反应过程中产生了中间产物N6-羟甲基腺嘌呤(hm6A)和N6-醛基腺嘌呤(frn6A),而ALKBH5催化的反应过程中没有发现这两个中间产物。这些研究对于我们理解AlkB家族蛋白的底物选择性以及进一步研究m6A去甲基化的反应机制具有重要意义。MexAB-OprM多药耐药外排泵是绿脓杆菌中一个重要的药物外排泵,对绿脓杆菌的高抗药性起到了显著作用。NalD蛋白是MexAB-OprM多药耐药外排泵的第二个调控蛋白,但是其调控机制还不清楚。为了进一步了解NalD蛋白的性质,我们对NalD蛋白进行表达与纯化,并开展了一系列的生物化学实验。Thermal shift、凝胶迁移实验(EMSA)、等温滴定量热(ITC)以及体内荧光报告实验的结果表明新生霉素能够诱导NalD蛋白与MexAB-OprM多药耐药外排泵的启动子DNA解离,从而激活外排泵的表达。此外,我们还成功解析了NalD蛋白的晶体结构。通过与恶臭假单胞杆菌中的TtgR蛋白进行结构比对,并进行EMSA、ITC、突变菌株平板实验,我们发现氨基酸Asn129和His167参与了NalD蛋白与新生霉素之间的相互作用。这些实验结果揭示了MexAB-OprM多药耐药外排泵调控体系的多样性,并为进一步了解细菌的抗药性提供了研究基础。NalD蛋白与大肠杆菌中的四环素抗性调控蛋白TetR都属于TetR转录调控蛋白家族。结构比对的结果表明,NalD蛋白与TetR蛋白具有很高的相似性,尤其在DNA结合区域。为了改造NalD蛋白使其能够识别TetR蛋白的DNA序列,我们尝试利用蛋白质工程技术将NalD蛋白的DNA结合区域替换成TetR蛋白中的对应区域。改构蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中与分子伴侣质粒(Chaperone plasmid)共表达,并用FPLC系统进行纯化。EMSA实验发现改构蛋白仍然具有生物活性,而且能够特异性识别TetR蛋白的DNA结合序列。这表明根据已知蛋白的结构对其功能进行改造是成功的。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51

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本文编号：1290909