红藻光合作用藻胆体—类囊体膜的超分子结构及其对缺氮的响应

发布时间：2017-12-15 07:10

  本文关键词：红藻光合作用藻胆体—类囊体膜的超分子结构及其对缺氮的响应

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【摘要】：光合作用是地球上最重要的生化过程,由光合膜内的一系列色素蛋白相互协作完成。真核红藻是真核光合生物演化过程中非常重要的环节,其光合系统具有较多和原核蓝藻相似的特点,是具有重要研究意义的光合生物门类。蓝藻和红藻光合膜的结构比较特殊,类囊体膜表面覆盖了一层外置的光合天线——藻胆体(phycobilisome,PBS)。藻胆体是由藻胆蛋白(phycobiliproteins,PBPs)和连接蛋白高度有序装配而成的超分子复合物,主要有四种拓扑结构类型:半盘状、半椭球状、束状和块状。在自然环境中,包括蓝藻和红藻在内的光合生物进化出了多种响应机制以适应不利的生存环境。例如,在缺氮环境中,非固氮蓝藻及红藻的藻胆体会被降解,为藻体生存提供氮源。尽管氮元素是限制光合生物生长的关键性决定因素之一,但目前依然缺乏对氮胁迫下植物和藻类光合膜超分子结构动态变化的直接观察。而原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)技术是一种在近生理条件下研究天然光合膜超分子结构的强大有效的方法。紫色细菌及高等植物的光合膜已经利用AFM进行了详细的研究,但有关蓝藻和红藻光合膜的AFM研究却非常少。半盘状藻胆体的精细三维结构已经明确,但红藻的半椭球形藻胆体精确结构依然不清楚。目前对红藻藻胆体-类囊体膜的超分子结构研究仅局限于原红藻纲单细胞红藻紫球藻Porphyridium cruentum 对不同进化地位的红藻藻胆体的形貌结构及其在类囊体膜上排布模式的多样性缺乏研究。光合膜超分子结构与光合性能密切相关,而叶绿素(chlorophyll,Ch1)荧光动力学与放氧生物的光合作用密切相关,这项技术已经被广泛应用于红藻光合作用的研究中,探究了其对不同生长条件的适应机制,比如辐照度、温度、重金属、盐度等。然而,有关营养限制后红藻光合性能的研究相对缺乏。本论文围绕红藻光合膜及藻胆体的结构、性能及环境调控,通过膜生物化学、AFM、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)以及光谱学等手段进行了多方面的研究,取得了如下研究结果:一.单细胞红藻紫球藻藻胆体-类囊体膜超分子结构研究为了研究红藻藻胆体-类囊体膜的表面超分子形貌,我们通过比较温和的方法提取了紫球藻的完整藻胆体-类囊体膜囊,利用吸收光谱和荧光光谱检测了其结构和功能的完整性,利用AFM探究了藻胆体-类囊体膜及其上藻胆体的超分子结构。同时我们分离了完整的藻胆体,电泳检测了其组分。我们的研究发现:类囊体膜充满了整个藻体且大部分区域平行排布;提取的藻胆体-类囊体膜的结构和功能是完整的;藻胆体-类囊体膜囊绝大多数都近似圆形,直径范围为0.5-8.5μm,膜囊的厚度范围为45-65 nm;有的膜囊上存在折叠,说明部分膜囊在藻体中的空间形态并非处于同一平面;在一些膜囊上也会观察到缺口,说明类囊体膜囊之间可能存在连通,以方便物质的传输,缺口也有可能是膜囊内容物流出时导致的破损;藻胆体在类囊体膜表面紧密排布,大部是随机无序排布的;藻胆体为半椭球形,长约58±4nm,宽约40±3nm,高约27±2nm(n300),在类囊体膜上的密度为(384±17)/μm-2(n10)。我们的实验结果表明,AFM是研究天然状态下类囊体膜结构及藻胆体结构的强有力手段,相应的结果为我们对红藻类囊体膜及藻胆体天然结构的理解提供了重要的线索。二.紫球藻藻胆体-类囊体膜超分子结构缺氮调控研究为了揭示红藻光合膜超分子结构的缺氮调控机制,我们利用AFM并辅以其它技术研究了缺氮过程中紫球藻类囊体膜超分子结构的变化。我们对藻体的生长及Ch1含量进行了测定,检测了藻体及分离的类囊体膜、藻胆体光谱的变化,以表征缺氮后藻体的生理生化状态,结果显示缺氮过程中藻细胞数量增加,但其增殖速率要小于对照;藻体Ch1的含量逐渐降低,说明光系统受到了缺氮的影响;光谱变化表明藻胆蛋白的含量逐渐减少到了相当低的水平,说明藻体中大部分藻胆体被降解了,藻体颜色的变化也证明了这一点。为了研究缺氮后藻体内类囊体膜的整体变化,我们利用TEM观察了藻体的超薄切片,藻体内类囊体膜明显减少,失去了紧密平行排布的结构特点。我们对分离的藻胆体进行了电泳分析,检测了缺氮后藻胆体组分的变化。利用AFM扫描了缺氮后的藻胆体-类囊体膜,以观察缺氮后藻胆体-类囊体膜及藻胆体超分子结构的变化,结果显示类囊体膜囊仍然保持了圆形形态,其直径随缺氮时间延长有轻微的增加;藻胆体在膜上的密度逐渐降低,缺氮20天时,藻胆体的密度减少到了仅51/μm-2;藻胆体逐渐变小,缺氮20天后藻胆体的长宽高分别减少了大约15%、23%、48%,但其仍保留了半球状的形态;在类囊体膜上出现了孔洞,孔洞的分布遍及整个膜片,随着缺氮加剧,孔洞变多变大。为了确定缺氮类囊体膜上缺失的复合物为藻胆体,并对膜上的孔洞问题进行深入研究,我们进一步对无藻胆体膜进行扫描观察。最后我们对严重缺氮的紫球藻进行了补氮恢复实验,以确证我们的实验结果。补氮后,培养液颜色由黄绿色变为深红色,光谱得到恢复,类囊体膜上藻胆体数量增多,这些结果表明重新添加氮源后藻胆体得到了恢复。AFM获得的结果有助于我们更好地理解氮胁迫下类囊体膜的变化以及藻胆体的降解机制。我们的工作第一次直接观察了光合生物为应对氮胁迫而引起的类囊体膜超分子结构的变化。三.半椭球形藻胆体高分辨率结构研究利用AFM天然直观的优势,我们对位于紫球藻类囊体膜上的藻胆体结构进行了研究。首先我们对扫描探针、扫描参数以及制片方法进行了改进优化。而后对类囊体膜上拥挤状态下的规则排布和不规则排布藻胆体分别进行了 AFM扫描,拥挤排布的藻胆体可按长轴方向分为两部分,在中间部位有一道明显的沟回,两侧可进一步观察到排布相似的圆形沟回,说明藻胆体很可能是长轴对称结构。为了进一步提高分辨率,我们通过缺氮、低盐透析和缺氮恢复三种方法使类囊体膜上藻胆体稀疏,以观察到更多结构信息。缺氮后类囊体膜上藻胆体数量会减少,基于这一自然反应,对缺氮20天类囊体膜上的藻胆体高分辨率结构进行了研究。我们可以观察到比拥挤状态下的藻胆体更多的细节结构,说明稀疏状态下的藻胆体更有利于高分辨观察。在低盐缓冲液中藻胆体会从膜上解离,同时自身也会发生解离,因此我们人为降低了藻胆体在膜上的密度,破坏了藻胆体结构的完整性。我们观察到了更多的藻胆体内部结构,为我们提供了更多有关半椭球形藻胆体的结构信息。缺氮恢复过程中类囊体膜上会有新的藻胆体合成,膜上会存在不同合成状态的藻胆体,我们通过对缺氮恢复中藻胆体的高分辨形貌观察初步研究了其合成过程。结果显示藻胆体的大小形态不均一,尺寸较大的藻胆体结构较为完整,尺寸较小的藻胆体上的沟回较少,说明其结构相对较为简单,其上球状凸起较少,说明杆的数量少,同样可以观察到中间明显的沟回,说明藻胆体可能是对称合成的。我们推测半椭球形藻胆体首先合成核心结构,然后按长轴对称逐渐合成杆,杆的数量及长度逐渐组装成正常水平。综上,稀疏状态下的AFM高分辨率成像从另一角度为我们提供了更多有关半椭球形藻胆体的结构信息。四.利用叶绿素荧光动力学研究紫球藻缺氮后的光合性能氮是植物和藻类生存所需的最重要营养元素之一,而藻类的光合性能与氮源的丰度有关。Ch1荧光动力学与光合生物光合作用密切相关。本论文中,我们利用多色脉冲振幅调制(multi-color-pulse amplitude modulation,multi-color-PAM)荧光计检测了缺氮紫球藻的活体Ch1荧光动力学,包括慢速Ch1 a荧光动力学、快速光响应曲线(rapid light curve,RLC)和快速Ch1 a荧光动力学,分析了缺氮对光合性能的影响。缺氮后,光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ,PSⅡ)的光化学效率以及反应中心(reactioncenter,RC)的活性下降,PS Ⅱ发生光抑制;光合装置受损,光能转换效率下降,但电子传递能力没有下降(ETo/TRo,REo/ETo);PSⅡ供体端的水裂解系统受缺氮影响严重,导致了放氧复合物(oxygen-evolving complex,OEC)的失活,正向的K-band有力地支持了这一点;传递到PSⅡ的光能减少导致了更大比例的能量用于光化学反应,热耗散的比例下降,如qP和qN所示;RLC显示缺氮藻体对高光强的耐受力和抵抗力下降;VOI显示缺氮藻体到达P相的时间增加,末端电子受体库增大;缺氮后活性反应中心的密度降低。我们的研究显示,氮胁迫后紫球藻的光合装置受损,光合性能下降。五.多细胞红藻条斑紫菜和多管藻藻胆体-类囊体膜超分子结构研究为了研究不同红藻光合膜超分子结构之间的关系,我们以原始红藻纲的多细胞大型红藻条斑紫菜Porphyra yezoensis和真红藻纲的多细胞大型红藻多管藻Polysiphonia urceolata为研究材料,以紫球藻的光合膜研究为基础,对这两种进化地位较高的复杂红藻藻胆体-类囊体膜超分子结构进行了研究。我们利用吸收光谱和荧光光谱检测了分离的藻胆体-类囊体膜结构和功能的完整性,利用AFM对藻胆体-类囊体膜及其上藻胆体的超分子结构进行了研究。研究发现,提取的藻胆体-类囊体膜的结构和功能是完整的,分离的条斑紫菜藻胆体-类囊体膜形貌主要有两种类型:一种是不规则膜片,膜上孔洞较多,平整性差,大小约1-10 μm,厚度约35-75 nm;一种是同紫球藻类似的圆形膜片,直径约1 μm,膜片厚约35-65 nm,膜上孔洞少,表面比较平整均一。藻胆体排布紧密无序,为半椭球形的,边界不明显,长约52 nm,宽约40 nm,高约18 nm。分离的多管藻藻胆体-类囊体膜整体形貌不规则,膜上孔洞较多,平整性差,膜片厚约35-60 nm。藻胆体排布紧密无序,膜上存在半椭球形藻胆体,长约49 nm,宽约34 nm,高约23 nm,同时也存在一些形状不规则或者是砖块状排列成行的结构,我们推测膜上除了半椭球形藻胆体外还可能存在其它类型的藻胆体。我们第一次利用AFM直接观察到了大型红藻的藻胆体-类囊体膜的天然形貌,深化了对红藻捕光复合物(light-harvesting complexes,LHC)的研究,对红藻光合膜超分子结构以及光合体系的进化有更加深入的理解。本论文利用AFM、TEM、PAM分析技术结合光谱学以及生化实验等手段,对红藻光合膜超分子结构及缺氮调控、半椭球形藻胆体超分子结构、红藻氮胁迫下光合性能的调控进行了研究。从全新的角度直观地揭示了缺氮后红藻类囊体膜超分子结构的调控机制。加深了对半椭球形藻胆体的三维超分子结构的了解。提供了有关红藻光合膜超分子结构以及光合体系进化的相关信息。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q945
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本文编号：1291043