提高法夫酵母合成虾青素水平的策略及代谢调控特征分析

发布时间：2017-12-15 08:19

  本文关键词：提高法夫酵母合成虾青素水平的策略及代谢调控特征分析

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【摘要】：虾青素(astaxanthin)是一种具有多种生物活性的含氧类胡萝卜素,可在水产养殖、功能食品、保健品和化妆品等领域应用。法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是生产虾青素并作为饲料添加剂的菌株,但其法夫酵母细胞中虾青素合成适宜在低温下进行、易受葡萄糖的代谢阻遏等特点,限制了其工业应用。本室前期经诱变获得了中温型耐糖高产虾青素突变菌株MK19。本研究拟进一步探讨提高虾青素产量的策略,并分析高产菌株色素合成代谢流的特征及调控机制。实验证明,由H202和高浓度NaCl刺激产生的氧化压力,可使MK19虾青素产量分别提高300%和63%。在菌株生长前期,添加少量H202(36h添加5mM)和初始NaCl浓度为0.1%(w/v)的条件,最有利于虾青素的积累。在检测类胡萝卜素组成、色素合成基因转录、胞内过氧化氢酶酶活(CAT)和H202水平的基础上综合分析,发现氧化压力使更多的萜类化合物代谢流进入虾青素合成途径；促进β-胡萝卜素和未知色素等合成前体转化为虾青素；过氧化氢和NaCl的刺激分别提高了色素合成基因crtl和crtE的转录水平；类胡萝卜素优先于CAT被用于细胞内自由基的清除。在MK19中发现一种未知色素的积累,通过HPLC、高分辨质谱和核磁共振等技术,鉴定其为3-羟基-4-酮基红酵母烯(HDCO),是法夫酵母中单环色素合成途径的主要产物。为了将HDCO进一步转化为虾青素,成功构建了虾青素合成酶(CrtS)过表达菌株CSR19,摇瓶培养CSR19的虾青素产量为25.3 mg/L,较出发菌株MK19提高了33.5%,且胞内虾青素占总色素比例达到84%。q-PCR检测结果表明,重组菌株类胡萝卜素合成基因间具有共调控的关系,crtS基因的过表达,刺激了整个色素合成途径的活跃。CrtS具有双功能酶的活性,可以同时作用在双环和单环色素途径,并可执行催化HDCO向虾青素转化的功能。不仅提出了法夫酵母中一条新的虾青素合成途径,也为有效地控制法夫酵母的培养水平和提高虾青素产量,提出了可行策略。MK19是目前报道的耐受初始葡萄糖浓度最高的法夫酵母菌株,是探讨菌株脱葡萄糖阻遏机制的有利材料。对其代谢产物和相关基因表达水平分析发现,crtYB基因的脱糖调控是MK19细胞生长及虾青素合成耐糖的主要原因。通过5'RACE和启动子截短实验,界定了crtYB基因的功能启动子区域。在此基础之上,通过同源比对和功能验证,首次发现了法夫酵母中调控crtYB基因表达的葡萄糖代谢阻遏子CREA。与野生菌株相比,MK19中不但creA的表达量低,并且CREA多处于无活性状态,导致色素合成基因的转录脱葡萄糖调控。本研究结果,不仅初步解释了突变菌株脱葡萄糖阻遏的原因,也为进一步提高法夫酵母在高浓度葡萄糖下的虾青素生产能力提供了重要线索。本文探究了调控氧和碳源两种重要的生理因素增产虾青素的策略,不仅为生产虾青素提供了高产稳定的备选菌株,同时借助代谢产物跟踪检测、基因表达水平和生物信息学等相关分析,揭示了法夫酵母虾青素合成的两条途径及其调控特征与规律。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936
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本文编号：1291271