枯草芽孢杆菌尿酸氧化酶的定向进化

发布时间：2017-12-16 03:12

  本文关键词：枯草芽孢杆菌尿酸氧化酶的定向进化

  更多相关文章： 尿酸氧化酶 定向进化 易错PCR DNA重组 蛋白质结晶

【摘要】：尿酸氧化酶是嘌呤代谢路径中重要的酶,它能够降解尿酸形成尿囊素,后者在水中的溶解度是前者的十几倍,能够大大降低体内尿酸的含量。人体中缺乏有活性的尿酸氧化酶,因此体内的尿酸水平较高,这在进化上是非常具有意义的,然而当体内尿酸浓度长期处于高水平状态时,会引发包括痛风在内的多种疾病的发生。临床上治疗痛风主要依靠别嘌呤醇,它通过抑制黄嘌呤氧化酶从而减少体内尿酸的生成。然而,别嘌呤醇的使用增加了肾脏的负担并且可能会引起过敏反应。尿酸氧化酶作为一种新型的降解尿酸药物不仅能够迅速降低血液中尿酸的水平,还能够降解体内沉积的尿酸晶体并且不产生任何副作用。同时尿酸氧化酶还可以用来制作尿酸检测试剂盒,能够快速检测出尿酸的浓度,这在临床诊断上是非常具有意义的。本研究以枯草芽孢杆菌来源的尿酸氧化酶为出发点,通过易错PCR,DNA重组等多种手段构建突变库,最终经过多轮的突变和筛选我们获得了两个酶活力单位明显增高的突变体6E9和8E279,这两个突变体的酶活分别是9.09U/mg和10.44U/mg,均为野生型尿酸氧化酶活力单位的3倍左右。我们人工合成了黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因,并检测其酶活力,发现其酶活与突变体8E279类似。同时我们检测了突变体和野生型的理化性质,发现突变体相比野生型尿酸氧化酶具有更低的最适反应温度和最适pH,更好的热稳定性。我们利用定点突变技术,构建出17个含有单突变体的菌株,通过检测纯酶活力单位大小,我们知道D44V,Q268R和K285Q这三个位点的突变导致酶活力增加的幅度最大。我们进一步将这三个突变位点随机组合,得到酶活力单位最高的突变体DQ,它的动力学参数Km,kcat/Km和酶活力单位分别增加了 68%,83%和129%。我们利用同源建模得到枯草芽孢杆菌的模拟结构,结果表明,所有的突变位点都不在活性位点附近,虽然它们的突变导致了酶活性的改变,但是只从静态结构并不能解释具体的催化机制;我们同时选择了一些突变位点进行回复突变,发现这些突变位点在突变体和野生型中的效应明显不同,这暗示这些突变位点具有非常强的异位显性,说明这些突变位点除了通过平衡结构外还可能通过蛋白质动力学对催化活性产生影响。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q814.2

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 开雷;岳珂;马晓航;;尿酸氧化酶的研究及其应用[J];科技通报;2008年02期

2 岳俊杰;任仙文;谭明峰;李北平;王月兰;方宏清;梁龙;;人尿酸氧化酶结构的同源模建和生物信息学分析[J];计算机与应用化学;2007年12期

3 刘树玲;李建民;李冰;杨秀旭;付玲;陈薇;;抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体的制备和初步鉴定[J];生物技术通讯;2007年03期

4 薛t，

本文编号：1294463