螺旋藻抗菌肽的纯化鉴定及其抑菌机理的研究

发布时间：2017-12-16 18:02

  本文关键词：螺旋藻抗菌肽的纯化鉴定及其抑菌机理的研究

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【摘要】：螺旋藻(Spirulina)属于原核生物,是蓝藻门颤藻科螺旋藻属。螺旋藻生长迅速,生物量大,蛋白质含量高,以螺旋藻为制备活性肽的来源,有其独特的优点。本研究从螺旋藻蛋白酶解物中提取、分离及筛选抗菌肽并对其结构和生化特性进行了鉴定,并全面剖析了抗菌肽SP-1对大肠杆菌的抑菌作用机理,主要结果如下：(1)螺旋藻蛋白经碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后,利用Sephadex G-25凝胶层析、C18反相高效液相层析、Superdex 75 10/300柱层析分离纯化后,得到具有抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰式阳性菌(金黄色葡萄球菌)的纯化组分,将其命名为SP-1。采用MALDI-TOF/TOF-MS以及LTQ串联质谱的方法对螺旋藻抗菌肽SP-1的结构进行分析鉴定, 最终确定SP-1为18个氨基酸(KLVD ASHRLATGDVAVRA)组成的阳离子小分子肽,分子量约为1878.97 Da。利用琼脂扩散法确定了纯化组分SP-1对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有较强的抑菌活性,其中,SP-1对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC值)为8mg/mL,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC值)为16mg/mL,且在较高浓度时(8×MIC值)仍无溶血活性,SP-1在一定浓度范围内使用时对正常哺乳动物细胞不具有毒性,特异性高。(2)通过圆二色谱分析抗菌肽二级结构的变化,研究发现SP-1在水溶液中以无规则卷曲构象为主(无规则卷曲含量58.1%),当它置于仿膜疏水环境时能够调整为以β-折叠结构为主的二级结构,β-折叠含量为57.2%。以大肠杆菌为指示菌,对螺旋藻抗菌肽SP-1的抑菌机理进行研究,结果表明抗菌肽SP-1能够迅速包围菌体,作用于细胞表面,发生聚集现象,使大肠杆菌的细胞外膜和细胞质膜的通透性变大,且对细胞质膜的透化作用更强,并随着作用时间的延长,破坏细胞膜完整性,导致胞内的离子(K+)泄漏,最终在细胞膜上穿孔进入细胞内部,说明细菌膜结构是抗菌肽SP-1攻击的首要靶位点。凝胶阻滞试验结果显示,SP-1进入细胞内部后可与大肠杆菌基因组DNA结合,结合能力与抗菌肽SP-1的浓度呈正相关,说明SP-1能够进入大肠杆菌细胞内累积,其作用靶标是DNA。SP-1与大肠杆菌DNA作用后,首先影响的是基因的转录功能,使大肠杆菌细胞周期中Ⅰ期(G1期)细胞数目显著增加,说明抗菌肽SP-1首先抑制了细菌的RNA的合成,进而抑制了细菌DNA的合成,最终导致细菌死亡。本研究分离纯化得到的螺旋藻抗菌肽SP-1,通过破坏大肠杆菌的细胞膜,阻断其RNA的转录和DNA的合成而导致细菌的死亡,从而在细胞和分子水平明确了螺旋藻抗菌肽SP-1对大肠杆菌细胞的抑制作用。本研究结果为天然防腐剂及抗生素替代物的应用与开发奠定了坚实的理论基础,同时也为新型抗菌肽的开发与利用提供新的资源和途径,使抗菌肽在食品、医药、化妆品等诸多领域都能够有着可观的应用前景和研究价值。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q946

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