TLR3调控新城疫病毒复制及细胞自噬的分子机制研究

发布时间：2017-12-22 02:27

  本文关键词：TLR3调控新城疫病毒复制及细胞自噬的分子机制研究　出处：《扬州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)可以引起禽类的呼吸道疾病和死亡,给养禽业造成巨大的经济损失。NDV也能在人类肿瘤细胞中复制并破坏肿瘤细胞,因此作为一种溶瘤病毒被广泛关注。近年来,病毒感染诱导的天然免疫机制逐渐成为研究热点。Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)是新发现的一类细胞表面受体,其中的TLR3能够识别病毒相关的dsRNA或dsRNA模拟物poly (I:C),在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。目前,关于NDV诱导的TLR3信号通路及其对病毒复制的影响还没有相关报道,激活的TLR3信号通路与细胞自噬之间是否具有联系也不清楚。为了探究这些问题,我们开展了以下的研究：1.NDV感染与TLR3信号通路的激活用NDV Herts/33强毒株感染HeLa细胞系,以Western-blot和免疫荧光方法鉴定被感染细胞的TLR3变化。发现Herts/33强毒株感染能够显著提高TLR3的水平,在感染后12-24h最为明显。使用dsRNA特异性抗体进行染色,发现NDV复制过程中能够产生dsRNA,并激活TLR3信号通路；而紫外灭活的NDV不能激活该通路。采用NDV La Sota弱毒株进行了相同的实验,所得到的结果与Herts/33强毒株相同。由此可见,NDV在感染细胞内复制过程中产生的dsRNA能够被TLR3识别并将其活化。2.TLR3信号通路与NDV复制的关系构建人TLR3 (hTLR3)的真核表达质粒,转染HeLa细胞系后检测过表达TLR3对NDV感染的影响。hTLR3过表达能够显著抑制病毒蛋白的转录和翻译,减少细胞上清中的病毒滴度。将TLR3干扰RNA (siRNA)转染HeLa细胞系后,TLR3的表达受到抑制,病毒蛋白的转录和翻译水平上调,病毒滴度增加。以real-time PCR检测过表达TLR3后对干扰素和炎性因子产生的影响,IFN-β、IL-6、 IL-8和IFIT1 mRNA水平与对照组发生显著变化。使用荧光素酶报告基因的方法检测了转染TLR3的细胞在感染NDV以后IFN-β、NF-κB启动子活性,两个启动子的活性显著增强。上述结果表明,TLR3在NDV感染中通过诱导干扰素的释放和炎症因子的产生发挥其抗病毒作用。3.抗NDV感染天然免疫中TLR3和RIG-I信号通路的关系评价了TLR3和视黄酸诱导基因蛋白-I(retinoic acid-inducible gene 1, RIG-I)信号通路在抗NDV感染中作用。将TLR3 siRNA、RIG-I siRNA、TLR3 siRNA+RIG-I siRNA分别转染HeLa细胞,然后感染NDV,以real-time PCR的方法检测IFN-β、IL-6、IL-8.IFIT1 mRNA水平的变化。发现单独干扰TLR3的细胞中炎症因子IL-6、IL-8 mRNA表达的水平低于单独干扰RIG-I的细胞,而单独干扰RIG-I的细胞中IFN-p mRNA表达水平低于单独干扰TLR3的细胞。此外我们还通过双荧光素酶报告基因的方法检测了IFN-β、NF-κB启动子活性的变化,同样发现单独干扰TLR3时NF-κB启动子的活性低于单独干扰RIG-I时,单独干扰RIG-I时IFN-β启动子的活性低于单独干扰TLR3。综上所述,两种天然免疫的模式识别受体TLR3和RIG-I对下游干扰素和炎性因子的调节方式是不同的,两者共同参与了NDV介导天然免疫反应。4.TLR3信号-通路激活与细胞自噬的关系用TLR3配体poly (I:C)处理A549细胞系,转染GFP-LC3质粒12-24 h后,GFP-LC3在细胞中呈现显著的点状分布;Western-blot显示细胞内的LC3-I向LC3-Ⅱ的转化。同时,用poly(I:C)处理HeLa田胞系,也得到了相同的结果。说明TLR3激活后可以引起自噬。为了探究TLR3激活后引起的白噬是否为完整的自噬,我们用poly(I:C)刺激后对p62的降解进行了检测,使用溶酶体抑制剂处理后western-blot检测LC3-II的turnover,并且通过荧光观察了GFP-LC3与LAMP1的共定位。综上所述,poly (I:C)刺激后能够引起细胞自噬,并且产生完整的自噬流。5.TLR3信号通路激活后诱导细胞自噬的机制通过免疫荧光的方法,观察了TLR3及下游蛋白与Beclin-1的共定位。通过免疫共沉淀的方法,对TLR3及下游接头蛋白与自噬相关蛋白进行互作研究。结果显示,TLR3信号通路激活后,下游接头蛋白TRIF与Beclin-1能够发生部分共定位,并且发生相互作用,互作的区域在TRIF的TIR结合域和Beclin的BH3功能域。自噬未激活时,Beclin-1与B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)结合。综上所述,TLR3信号通路激活后,下游接头蛋白TRIF与Beclin-1相互作用,竞争性地抑制Bcl-2与Beclin-1结合,正向调控细胞白噬的过程。6.NDV病毒蛋白NP、P通过内质网应激诱导细胞自噬分别构建了NDV各结构蛋白的真核表达质粒并转染A549细胞系,以Western-blot和荧光试验鉴定细胞自噬的产生以及内质网稳态的改变。结果显示,NDV NP和P转染细胞后能够引起细胞自噬以及内质网应激。此外NP和P还能够激活非折叠蛋白通路(unfolded protein response, UPR)中的PERK和ATF6通路,而XBP1通路不被激活。将PERK和ATF6干扰后能够抑制NDV诱导的自噬,降低NDV的复制水平。结论：本研究证明了TLR3信号通路在NDV感染细胞后可以被激活,TLR3通过促进下游细胞因子和干扰素的释放发挥抗病毒作用；证实Beclin-1能与TLR3信号通路中的接头蛋白TRIF互作,促进自噬的发生；发现NDV的NP和P蛋白能够通过内质网应激相关的非折叠蛋白通路调控细胞自噬。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1318092