可逆光开关荧光蛋白的开发及其在超高分辨率显微成像中的应用

发布时间：2017-12-25 18:26

本文关键词：可逆光开关荧光蛋白的开发及其在超高分辨率显微成像中的应用　出处：《华中师范大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来超高分辨率显微成像技术成为生物领域研究中不可或缺的工具,极大地促进了生命科学的发展。同时,人们对优良探针的渴望日益迫切。可逆光开关荧光蛋白(reversibly switchable fluorescent proteins,RSFPs)是一类在特定光照下能够进行亮-暗状态可逆转变的荧光分子探针,它们在活细胞超高分辨率成像技术中发挥着重要的作用。然而,现如今可逆光开关荧光蛋白的品种单一,性能需要优化。因此,我们选择性质较好、使用广泛的光转化荧光蛋白mEos 3.1为模板,在其His62位进行饱和定点突变,获得了一系列具有高亮度,高稳定性和高信噪比等不同优良性质的新型荧光蛋白,它们和Dronpa一样能够被488nm光照射转化为暗态,405 nm光激发至亮态且反复多次循环。我们把这类新型的绿色单体光开关荧光蛋白命名为Skylan (sky lantern)家族。在超高分辨率光学波动成像(super-resolution optical fluctuation imaging, SOFI)中,新型荧光蛋白Skylan-S展示了很高的光稳定性,对比度和波动状态的平均荧光值,比现有适用于SOFI成像探针Dronpa的图片像素荧光波动范围提高了四倍,从而获得了更高的SOFI分辨率。基于这些特性,我们使用Skylan-S标记网格蛋白应用于SOFI成像获得了高于100 nm的空间分辨率,成功解析出成熟的网格蛋白包被小泡(CCPs)环状结构,而且在1.5 s的超高时间分辨率下长时程拍摄持续60s连续重构出40张CCPs的动态SOFI图像。这些结果说明Skylan-S适合用于长时程、超高时间-空间分辨率的SOFI成像技术。活细胞条纹模式光激活非线性结构光照明显微技术(PA NL-SIM)中,新型荧光蛋白Skylan-NS具有很高的对比度,在“亮”状态拥有较高的亮度和光稳定性,能够在100 W/cm2极低的光照强度下进行活细胞超高分辨率成像,获得了高达60nm的分辨率,且在亚秒级时间内大视野持续采集十多个时间点。同时,Skylan-NS与Dronpa和rsEGFP2相比,标记细胞骨架蛋白能够得到更精细,信噪比更高的结构图像。这些优良特性使得Skylan-NS适合应用于多种活细胞超高分辨率成像系统,从而获得更高的分辨率。超高分辨率成像技术的发展和应用使得我们能够对生物分子进行精确定位。在成功发展了一些优秀的荧光探针用于超高分辨率成像之后,我们开始用来解决生物学问题。已知的凋亡体是在细胞凋亡早期用来激活胱天蛋白酶caspase起始物的多蛋白复合体。哺乳动物细胞中凋亡体的装配包括细胞凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1与细胞色素c及ATP/dATP结合后激活胱天蛋白酶caspase-9,但是昆虫的凋亡体装配途径至今仍不清楚。因此我们使用Skylan家族以及多种荧光蛋白探针分别标记鳞翅目昆虫凋亡体的各组分蛋白,为简化实验体系,在哺乳动物细胞表达并进行多色3D-SIM成像,展示了在细胞凋亡初期,鳞翅目细胞色素c从线粒体中释放出来与细胞质中的Apaf-1结合进而形成凋亡体过程中的多蛋白定位及结构变化。我们首次应用3D-SIM结构光照明显微成像技术在细胞中观察到鳞翅目凋亡体的圆形轮状3D结构；更为重要的是,它以较高的分辨率展示了鳞翅目凋亡体的装配过程,这是之前普通荧光显微镜和电镜不能提供的,由此体现了Skylan探针在解决生物学问题中的良好应用。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51;Q-336

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