蛋白质动态结构研究的化学生物学方法

发布时间：2018-04-03 03:09

本文选题：蛋白质动态学　切入点：顺磁探针　出处：《中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所)》2016年博士论文

【摘要】：蛋白质的结构和动态学特征是其行使功能的重要基础。获得高时间和空间分辨的蛋白质结构和动态学特征对了解生命运动的本质、疾病的机制以及药物的开发等有着十分重要的意义。解析蛋白质结构和动态学的主要手段包括有：X射线晶体衍射、小角X光散射、冷冻电镜、分子动力学模拟、荧光共振能量转移以及固体／液体核磁共振等方法。其中,液体核磁共振和冷冻电镜的最大优势就是可以观察生物大分子在水溶液中的结构和功能的特征,其观察的方法相比于X射线晶体衍射等方法更加趋近于生物大分子真实的生理条件。溶液顺磁弛豫增强技术(solvent paramagnetic relaxation enhancement, sPRE)是近几年发展出来的一种使用液体核磁共振来解析蛋白质的结构动态学的新手段,sPRE通过顺磁中心的电子与核的偶极-偶极相互作用,提供蛋白质长程的距离和动态学的信息。传统顺磁弛豫增强技术(paramagnetic relaxation enhancement, PRE)研究蛋白质结构和动态学的方法是通过在蛋白质上引入Gd3+, Mn2+,氮氧自由基等顺磁探针,观察探针的顺磁中心与蛋白质上核的偶极-偶极相互作用来获取距离的信息,而sPRE实验实际上是观察蛋白质上核的暴露程度的信息。此外,像传统PRE一样,sPRE还可以获得蛋白质瞬态的、低分布的动态学信息。以往通过sPRE解析蛋白质结构所使用的探针是Gd-DTPA-BMA(又称钆双胺,Omnicscan(?)), DTPA-BMA通过8个配位原子外加溶液中的水分子与三价钆离子形成配位。然而在许多蛋白的sPRE实验中,我们发现使用Gd-DTPA-BMA探针在某些条件下会与蛋白质的H-N发生氢交换,使得sPRE值存在异常(与理论计算值和其他实验值明显不符),影响了sPRE对蛋白质结构描述的准确性。为了改善这一情况,我们发展了新的运用于解析蛋白质结构的溶液顺磁弛豫增强的探针Gd-TTHA-TMA和Gd-DTPA-BEA,这类探针可以解决原先在使用探针Gd-DTPA-BMA时存在的氢交换问题,可以更为准确的对蛋白质结构和动态学的信息进行精确地描述。相对于传统使用的Gd-DTPA-BMA探针,我们发展的Gd-TTHA-TMA可以提供10个配位基团给顺磁金属,因此可以消除水分子配位导致的氢交换对蛋白sPRE实验值准确性的影响。我们通过对不同的蛋白进行测试,sPRE结果证实Gd-TTHA-TMA探针可以提供更加可靠的sPRE实验值,可以对蛋白质的结构和动态学信息进行更加精确地描述。我们发现在某些情况下Gd-TTHA-TMA探针会与蛋白质的疏水区域发生结合,从而影响了sPRE的准确性。为此我们又开发了新的sPRE探针Gd-DTPA-BEA作为补充,与Gd-TTHA-TMA相互印证,获取更加准确可靠的蛋白质结构动态学的信息。随后,我们发展了一套sPRE实验联合分子动力学模拟来解析蛋白质结构和动态学的新方法。我们用腺苷激酶(AdK)蛋白作为研究对象,通过我们新发展的探针获得holo态和apo态的sPRE实验值,在分子动力学模拟的结构池中挑选吻合计算值的结构,解析出了AdK蛋白在各种状态下的动态学特征。相较于传统的PRE方法,新方法的优势在于可以不用连接探针影响蛋白质的结构；而相对于只能获取两点之间距离信息的荧光共振能量转移方法而言,新方法可以获得更多残基间的距离和动态学的信息。此外,sPRE除了解析蛋白质三级结构的动态学特征以外,我们还利用sPRE实验来解析蛋白质寡聚的四级结构的形态,通过不同寡聚状态下的human leptinW100D蛋白的sPRE实验,我们给出了蛋白三聚的界面,搭建了human leptinW100D蛋白的寡聚的四级结构模型。除了游离态的顺磁探针可以运用于sPRE实验之外,连接在蛋白上的顺磁探针可以用来解析传统的PRE和PCS获取蛋白质上距离和角度的信息。为此我们开发了一种基于点击化学的蛋白质定点标记的顺磁探针,该类探针可以通过生物正交的反应连接在蛋白质的非天然氨基酸上,具有优异的选择性和特异性,可以避免巯基连接探针的缺点。此外,荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)也是研究生物大分子结构和动态学的重要手段。我们发展了两种用于FRET实验的荧光探针IAM-Cyanine3和IAM-Cyanine5,其特点在于：1)相对于常用的探针,我们缩短了发光基团与蛋白质间的linker长度,使得探针具有更好的刚性,提高了FRET实验对蛋白质结构描述的准确性；2)我们改进了荧光探针反应连接的方式,使其具有更好的反应特异性。综上所述,本课题以发展解析蛋白质结构和动态学的化学生物学方法为主线,开发用于解析蛋白质结构和动态学的游离态的顺磁探针、标记顺磁探针、荧光探针为研究重点,开拓解析蛋白结构的新技术新方法,提高解析蛋白质结构和动态学的准确性。
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【学位授予单位】：中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q617;O657.3

【参考文献】