大肠杆菌Nissle 1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析

发布时间：2018-04-09 10:10

  本文选题：大肠杆菌Nissle　切入点：1917　出处：《扬州大学》2016年博士论文

【摘要】：大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917;EcN)是德国医生Alfred Nissle于1917年从一名抗腹泻士兵粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区疾病的侵扰。随后,在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为人用药Mutaflor(?)的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来,EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多,其内含的pMUT2、I型分泌系统以及V型分泌系统等皆用于将外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示属于细菌表面展示技术之一,其基于鞭毛蛋白的高变区可容纳外源多肽且组装成鞭毛丝进而实现外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技术较多在报道沙门氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鉴于EcN是强大效能益生菌,本研究首先构建了EcN无质粒克隆菌株EcNc (EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc),以其鞭毛蛋白高变区为切入点来探讨EcNc鞭毛表面展示。EcN中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒,且2个质粒在传代中很稳定,不易丢失；pMUT1带有ColE1类型复制系统,pMUT2含有类ColE2复制系统,然而对这2个隐秘大质粒的生物学意义了解较少。有研究报道大肠杆菌的致病性受到质粒的调控,且部分大肠杆菌菌株的抗性基因也可能与其隐秘质粒有关。为减少上述隐秘质粒对外源性重组质粒转化和基因组DNA操作带来的不便,同时考虑EcN作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的副作用,本试验使用限制性内切酶Sph I将携带sacB的自杀性质粒载体pRE112分别与隐秘质粒pMUT1、pMUT2连接,构建重组质粒载体pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,进一步应用竞争性抑制分别去除EcN自身携带的隐秘质粒,基于自杀性质粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培养基平板上实施自杀质粒自身消除,最后获得EcN无质粒克隆菌株即EcN△pMUT1△ApMUT2,命名为EcNc (EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)对无质粒菌株EcNc生长状况、生化试验、电镜观察以及体外细胞黏附检测,试验结果表明去除两个隐秘大质粒后的EcNc,其生长、生化特性、血清学、形态学特征、体外细胞黏附与原型EcN一致,利用获得的EcNc菌株,将更加方便质粒的转化和遗传相关生物学操作。基于编码EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对EcNc菌株的fliC基因进行敲除。首先纯化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表达盒的PCR扩增产物,电转化至已携带pKD46质粒的EcNc菌株中,在Red同源重组酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通过两翼同源序列与染色体对应靶基因序列同源重组,在氯霉素抗性平板上筛选到一次同源重组菌株EcNc △fliC::cat。再将质粒pCP20电转化EcNc △fliC::cat菌株,通过其在42℃C表达的Flp重组酶消除PCR片段中FRT位点之间的氯霉素抗性基因。经过PCR鉴定和DNA测序证明二次重组菌,即fliC缺失菌株EcNc △fliC构建成功。将pBR322-fliC电转化EcNc △fliC构建了回补菌株EcNc △fliC/pBR322-fliC。同时,以构建好的pU18-fliC重组质粒为模板,通过反向PCR分别构建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,双酶切后连接到自杀载体pRE112中,构建重组自杀载体pRE 112-fliC1、pRE112-fliC2,将其分别导入EcNc菌株中,通过一次重组、二次重组及DNA测序筛选到EcNc鞭毛蛋白基因部分高变区缺失的菌株EcNcfliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNc fliC2的成功构建,旨在进一步探索鞭毛蛋白高变区序列改变对EcNc性状的影响。测试EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生长性能、运动性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及体外细胞黏附、体内肠道定植能力。结果显示,各株细菌生化特性一致,生长性能没有差异变化；EcNc △fliC在半固体培养基上无运动性能,Western blot检测不到鞭毛蛋白的表达,且电镜下观察不到鞭毛形态,其对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则下降64%(p=0.002)、相对于EcNc fliC1下降52%(p=0.018)、相对于EcNc fliC2下降50%(p=0.01)。EcNc △fliC回补菌株EcNc △filC/pBR322-fliC与EcNc的特性相一致,对IPEC-J2的黏附能力恢复到EcNc的黏附水平；用Western blot能检测到EcNc fliC1、EcNc fliC2鞭毛蛋白的表达,电镜下亦能观察到鞭毛丝,但它们在半固体培养基上几乎不能运动,EcNc fliC1、EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则分别下降26%(p=0.124),29%(p=0.586),差异不显著；但EcNc fliC1对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高52%(p=0.018),EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高50%(p=0.01)。在体内肠道定植试验中,接种后第1 d、第3 d、第7d取样检测,各组细菌在同一肠段(回肠、盲肠或结肠)的定植能力无显著差异；但各组细菌在盲肠的定植数量高于各自在回肠和结肠的定植,尤其是接种后第1 d, EcNc/pBR322、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1/pBR322、EcNc filC2/pBR322在盲肠的定植显著高于其各自在回肠的定植数量。EcNc还具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他们也共同介导和促进细菌在动物体内的定植,使得EcNc △filC/pBR322也能在小鼠肠道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高变区分别缺失287-296位或者277-286位10个氨基酸后亦能表达鞭毛蛋白并形成鞭毛丝,且不影响重组菌在小鼠体内的定植能力,说明EcNc鞭毛蛋白高变区能容许部分氨基酸的缺失。随后本研究尝试以鞭毛基因高变区表面展示外源基因。以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对含六聚组氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn I、 Exnase TM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliC01、fliC02)的重组质粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02, fliC01、fliC02这两个片段为将六聚组氨酸肽(6His)基因分别插入EcNc fliC高变区774-775位和792-811位碱基之间的序列。将fliC01、fliC02片段分别插入自杀性载体pRE1 12,获得重组质粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,最终获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。对重组菌株生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验分析,结果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag单抗识别并且能组装形成鞭毛丝；EcNc fliC01、EcNc fliC02对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与EcNc相比无显著性差异。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能将其展呈于菌体表面。在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对分别含有BVDV (Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T细胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重组质粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT, fliCB、fliCT片段为将B细胞表位、T细胞表位基因分别插入fliC基因792-811位碱基之间构建的嵌合鞭毛基因片段。将fliCB、fliCT片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliCB、 pRE112-fliCT,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,筛选获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliCB、EcNc fliCT。两株重组菌株生长、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验与EcNc无显著差异；在半固体平板上,EcNc fliCB无运动性,而EcNc fliCT具有运动性。将EcNc、EcNc fliCB、EcNc fliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和肠道,检测小鼠体内产生抗B、T细胞表位的特异性抗体IgA、IgG,结果表明,免疫重组菌株EcNc fliCB能够刺激机体产生抗B细胞表位的IgG抗体(0.552±0.027),免疫EcNc fliCT同样能够刺激机体产生抗T细胞表位IgG抗体(0.515±0.049),空白对照组(免疫EcN)未检测出针对相应包被蛋白的IgG抗体。免疫EcNc fliCB小鼠肠道能检测出针对B细胞表位的IgA抗体(0.367±0.030),与空白对照组差异显著(0.040±0.017；p=0.040)；免疫EcNc fliCT小鼠肠道能检测出针对T细胞表位的IgA抗体(0.371±0.034),与空白对照组差异显著(0.024±0.010;p=0.025)。EcNc fliCB、EcNc fliCT能诱导B、T细胞表位抗原特异的体液及黏膜免疫应答。上述试验结果证明EcNc鞭毛蛋白不同高变区能携带一定大小的外源抗原并较好展呈于菌体表面,为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定了基础。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

【参考文献】

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本文编号：1725975