酿酒酵母异源蛋白高效分泌适配元件的发掘及人造纤维小体的构制

发布时间：2018-06-30 00:35

本文选题：酿酒酵母 + 分泌途径　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是食品级安全性的模式真菌,具有良好的产业化生产性能,是极具潜力的细胞工厂底盘细胞。虽然其具备完善的蛋白分泌途径及翻译后修饰系统,但异源蛋白分泌表达的活性普遍较低。而蛋白质的高效分泌表达,应用于生物技术方面的意义不言而喻。通过分泌途径,在酿酒酵母中高活性表达纤维素酶,是实现纤维素乙醇的统合生物加工过程(Consolidated bioprocess, CBP)的有效方式。CBP是将纤维素降解酶类的生产、纤维素底物的水解和糖份的乙醇发酵等几个过程的整合,通过一种微生物完成的生物加工过程。同时,厌氧细菌产生的纤维小体具有高效降解木质纤维素的特性,使其成为CBP构制的一种新尝试。本文以此为出发点,针对分泌途径的各个关键节点,进行改造,提高纤维素酶等蛋白的分泌效率,以发掘不同异源蛋白高效分泌适配元件。在此基础上,进行酿酒酵母人造纤维小体的设计和构建。本论文主要研究工作有：1、酿酒酵母高活性分泌p-葡萄糖苷酶促进同步糖化发酵产生乙醇纤维素水解的中间产物纤维二糖对纤维素酶的水解活性具有强烈的反馈抑制作用,从而降低纤维素的降解效率,限制乙醇转化率。而及时转化纤维二糖为葡萄糖并发酵为乙醇,可解除这种抑制。但许多真菌天然纤维素酶系中,水解纤维二糖的p-葡萄糖苷酶的活性较低。因此,将β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中高效表达,是促进木质纤维素同步糖化发酵产生乙醇的有效策略之一。本研究首先比较了三种来源的p-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中异源表达的胞外活性,选择了具有最高分泌活性的扣囊覆膜胞酵母(Saccharomycopsis fibuligera)β-葡萄糖苷酶SF-BGL1。然后通过多种信号肽的比较,发现克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菊粉酶(Inulp)的信号肽进一步促进了SF-BGL1胞外分泌,酶活达到了6.22 U/mL。SF-BGL1的高活性表达,使酿酒酵母高效代谢纤维二糖,且纤维二糖的发酵特性与葡萄糖基本相似。缺乏β-葡萄糖苷酶活性的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶系,与高效分泌SF-BGL1的酵母菌株进行同步糖化发酵微晶纤维素时,解除了纤维二糖的积累,使乙醇的产量比对照菌株(表达空质粒)提高了105%。更为重要的是,以酸预处理的玉米芯为同步糖化发酵底物,高效分泌SF-BGL1的菌株发酵产生的乙醇产量达到了21.5g/L,与对照菌株相比,提高了89%,并且,其发酵液中剩余总糖量下降了71%。本研究获得的高效BGL1分泌菌株,回补了瑞氏木霉纤维素酶系的不足,对提高木质纤维素同步糖化发酵产生乙醇的得率具有重要的应用价值。2、改造蛋白折叠和蛋白易位途径提高异源蛋白在酿酒酵母中的表达异源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1、内切葡聚糖酶CelA和α-淀粉酶在酿酒酵母中分泌表达时,造成了内质网非正确折叠蛋白响应,降低了蛋白的胞外分泌效率,因此增加蛋白正确折叠是提高蛋白分泌量的有效措施之一。我们超表达内质网分子伴侣Kar2p及Pdilp,发现协助蛋白折叠的分子伴侣Kar2p超表达后,只提高了BGL1的胞外活性,而促进二硫键正确形成的二硫键异构酶Pdilp超表达后,使三种异源蛋白的胞外活性均增加,其中包括不含二硫键的CelA。 BGL1、CelA和α-淀粉酶分泌量分别提高53%、17%和90%,说明Pdilp可有效促进上述三种异源蛋白的分泌。新生肽链正确易位到内质网中参与蛋白折叠,对蛋白的高效分泌也具有重要作用。新生肽链正确易位有蛋白翻译后易位和翻译共易位两种形式。超表达协助蛋白翻译共易位过程的信号识别颗粒关键组分Srp54p和Srp14p,明显提高了三种异源蛋白的胞外分泌量。Srp54p的超表达使BGL1、CelA和α-淀粉酶的酶活分别提高了56%、16%和52%,Srp14的超表达使其分别提高了44%、18%和38%。协助新生肽链正确折叠并参与其翻译后易位过程的胞质分子伴侣Ssalp,超表达后增加了BGL1的胞外活性。此外,蛋白的信号肽是蛋白易位过程中的重要影响因素。我们发现,不同信号肽对于Srp54p、Srp14p和Kar2p、 Pdilp超表达菌株中的胞外分泌增加趋势没有太大影响。但在Ssalp超表达菌中,信号肽SF和Yap3引导分泌的BGL1胞外活性均被提高,而Suc2并没有。同时,Ssalp能提高信号肽Yap3引导的BGL1胞外活性,却不适用于其引导的α-淀粉酶高效分泌。这说明,翻译共转运相关组分对异源蛋白的高效表达具有普遍的适配作用,并且不受信号肽的影响；而翻译后转运相关系组分Ssalp对异源蛋白具有适配差异性,并且其适配作用受到信号的影响。蛋白折叠和蛋白易位双重改造,具有一定的协同作用,能进一步的促进异源蛋白的分泌,其中Pdilp和Srp54p共同超表达后,使BGL1、CelA和α-淀粉酶的胞外分泌分别提高了72%,60%和103%。本研究首次实现了改造酿酒酵母蛋白易位途径提高异源蛋白胞外分泌的策略,为优化适配于异源蛋白表达的分泌途径提供了价值性的参考思路。3、阻断酿酒酵母高甘露糖糖基化修饰通过上调分泌途径和改变细胞壁完整性增加异源蛋白的产量异源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1、内切葡聚糖酶CelA和外切葡聚糖酶Cel7A在经过酿酒酵母分泌途径加工修饰的过程中,发生了高甘露糖糖链添加的N-糖基化修饰,该糖基化修饰可能或影响蛋白的生物活性,或降低蛋白的胞外分泌量。因此,研究不同糖基化修饰程度对异源蛋白分泌活性的影响对优化分泌途径具有重要的意义。在高尔基体高甘露糖糖链合成过程中,糖基转移酶Ochlp负责添加第一个甘露糖到中心糖链上；Mnn9p参与大约10个α-1,6-甘露糖糖基基链的合成；Mnnlp负责最后甘露糖糖基的添加。敲除OCH1和MNN9,使分泌至胞外的BGL1、CelA和Cel7A的分子量显著降低,大小接近理论分子量,同时,三种异源蛋白的胞外分泌活性也得到了大幅度增加。在OCH1敲除菌株中,BGL1、CelA和Ce17A胞外酶活分别提高了135%、102%和144%；在MNN9敲除菌株中,分别增加了156%、105%和230%。而敲除MNN1后,蛋白的分子量与野生型菌株基本一致,且只有BGL1的胞外活性提高了25%。这说明阻断酿酒酵母蛋白的高甘露糖修饰,能提高异源蛋白的分泌活性。根据三种异源蛋白不同修饰程度的N-糖链去除前后的酶活变化,分析得出OCH1和MNN9敲除导致N-糖链截短并不能提高BGL1、CelA和Ce17A的比酶活。BGL1、CelA和Cel7A的胞外产量与酶活相一致的增加幅度,说明OCHl和MNN9敲除增加异源蛋白胞外活性的主要原因是蛋白产量的增加。进一步分析发现,在OCH1和MNN9敲除菌株中,分泌途径中一些关键节点的分泌元件的表达被上调,其中包括参与蛋白折叠的基因KAR2和SSA1、蛋白降解的DERl和HRD3和膜泡运输的BOS1、ERV25、SNC2和SSO1,并且这些基因的上调不依赖于IRE1/HAC1介导的内质网胁迫响应机制的调控。这说明敲除OCH1和MNN9增强了酿酒酵母的分泌能力,从而增加了异源蛋白的胞外分泌量。同时,OCHl和MNN9的敲除造成了细胞壁完整性的损伤,使菌株对刚果红、荧光增白剂以及葡聚糖水解酶的敏感性增强,细胞壁中的甘露糖比例显著下降,并且增加了细胞壁的孔隙度,促进了异源蛋白穿过细胞壁分泌到胞外。敲除OCH1和MNN9减缓了细胞的生长,通过超表达参与细胞完整性损伤响应机制中的关键基因RHO1和PKCl,部分回补了细胞壁的损伤,并且略微恢复细胞的生长。本研究为糖基化改造与异源蛋白高效分泌的兼容性研究提供了新颖的视角。4、优化酿酒酵母膜泡运输提高胞外蛋白和表面展示蛋白的分泌量蛋白增量表达往往由于运输能力的不足,使加工修饰好的蛋白或在内质网中,或在高尔基体中积累,最终导致被降解。增强内质网-高尔基体和高尔基体-质膜的膜泡运输能力,对减少蛋白胞内积累具有重要的作用。参与内质网-高尔基体膜泡运输的元件Secl2p、Secl3p、Erv25p和Boslp超表达后,都能提高CelA的胞外分泌量,而其中,只有Secl3p使BGL1的胞外酶活增加了40%。同时,参与内质网-质膜膜泡运输的元件Ssolp、Snc2p、Seclp、Exo70p、Sec4p和Ypt32p超表达后,都能促进BGL1的分泌活性,其中最为明显的是相关膜泡与质膜融合的SNAREs蛋白Ssolp和Snc2p,使BGL1酶活分别增加了53%和61%。而针对于CelA的胞外分泌,其中只有Snc2p、Sec4p、Ypt32p能略微提高其胞外活性(10%-15%)。实验结果表明,膜泡运输改造能促进异源蛋白的高效分泌,但是不同蛋白在膜泡运输的限制节点不同,CelA的主要限制在内质网-高尔基体的膜泡运输,而BGL1的主要限制在高尔基体-质膜的膜泡运输。此外,表面展示蛋白也需要经过分泌途径的加工修饰。将CelA和BGL1通过酿酒酵母常用的并且已商业化的表面展示系统Aga1p-Aga2p锚定于细胞表面。通过酶活测定和流式细胞仪分析结果显示,内质网-高尔基体和高尔基体-质膜膜泡运输的改造,都能提高CelA的表面展示效率,其中,Bos1p、Exo70p和Sec4最明显,使CelA细胞酶活分别提高了71%、90%和51%。同时,BGL1的细胞酶活也都获得了一定的提高。这说明,无论是内质网-高尔基体还是高尔基体-质膜的膜泡运输改造,都可以提高通过Aga1p-Aga2p展示的异源蛋白分泌。本研究分析了膜泡运输改造对异源蛋白胞外分泌的影响,并首次研究其对细胞表面展示蛋白的影响,发现不同蛋白在运输环节的限制节点不同,对优化分泌途径提供了重要的参考建议。酿酒酵母纤维小体的构建是CBP的研究热点。在酿酒酵母中,纤维小体的构制需要实现支架蛋白和至少三种酶组分的异源表达。因此,将来源于热线梭菌初级支架蛋白CipA上的三个粘连模块和底物结合模块(CBM)作为微型支架蛋白ScafCipA3,通过凝集素(Aga1-Aga2p)表面展示系统,成功的展示于酿酒酵母细胞表面,且展示百分率达到40%。同时,将扣囊覆膜胞酵母的BGL1(具有较高表达活性,见摘要1)融合上热纤梭菌木聚糖酶XynC的对接模块作为纤维小体降解纤维二糖的酶组分。为了获得具有高活性的另外两个酶组分,比较不同来源外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合相应对接模块的表达酶活,其中,埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的外切葡聚糖酶CBH1中具有最高的分泌活性,同时,热纤梭菌的内切葡聚糖CelA具有较高的分泌活性。这些酶组分通过对接模块与粘连模块的作用,成功的自组装到酿酒酵母细胞表面的支架蛋白上,CBH1、CelA和BGL1的自组装百分率分别3.8%、19.3%和2.5%。当提高酶组分的浓度,降低支架蛋白表达菌浓度后,CBH1、CelA和BGL1的自组装百分率明显增加了,分别达到了7.4%、94.3%和9.0%。微型纤维小体可直接利用磷酸膨胀纤维素(PASC)产生的乙醇,但产量较低。本研究提出了酶组分的表达量不足是纤维小体自组装效率低的限制性因素之一,为优化纤维小体的策略提供了思路。6、酿酒酵母通过二硫键自组装新型纤维小体及其复杂化的构制纤维小体是通过酶组分上的对接模块与支架蛋白上的粘连模块相互作用,自组装形成的蛋白复合物。蛋白与蛋白间的相互作用包括多种方式,例如抗原抗体作用、通过二硫键的相互作用等,是丰富纤维小体自组装方式极具潜力的工具蛋白。酿酒酵母凝集素a是由亚基Aga1p和Aga2p便是通过二硫键相互作用形成的蛋白复合物,其中,Aga1p的1-149氨基酸结构域(命名为AGA)主要负责与Aga2p形成二硫键。基于凝集素a的形成方式,我们将Aga1p的1-149氨基酸结构域作为粘连模块,Aga2p作为对接模块,设计了通过二硫键实现自组装的新型微型纤维小体。由三个AGA与T. reesei外切葡聚糖酶的CBM融合形成的支架蛋白ScafAGA3,能够成功的通过Agalp的糖磷脂酰肌醇功能结构域展示于酿酒酵母的细胞表面,并且细胞的展示百分率达到了56%,明显高于热纤梭菌源的支架蛋白(约40%,见摘要5)。Aga2p与外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶融合作为纤维小体酶组分aCBH1、aCelA和aBGL1,都能在酿酒酵母中实现活性表达。利用细胞壁蛋白Sedlp展示AGA,与aCelA共表达后能发生自组装,且自组装的百分率为11.7%,说明AGA能够发挥粘连模块的功能。aCBH1、aCelA和aBGL1分别与支架蛋白ScafAGA3共表达后,在细胞表面的自组装百分比分别是12.1%、28.3%和5.8%。通过二硫键自组装的新型纤维小体,利用PASC限氧发酵,能够产生0.925g/L的乙醇,比对照菌株(不表达支架蛋白)提高了50%。进而,将ScafAGA3作为锚定支架蛋白,热纤梭菌源支架蛋白ScafCipA3作为初级支架蛋白,使初级支架蛋白通过二硫键自组装到锚定支架蛋白上,再将纤维素酶酶组分通过对接模块-粘连模块作用方式自组装到初级支架蛋白上,形成具有双层支架蛋白的纤维小体结构。CBH1、CelA和BGL1能成功的实现与初级支架蛋白的自组装,但是自组装百分率较低,而通过增加酶组分浓度,降低支架蛋白表达菌浓度,可明显增加三种酶组分的自组装细胞百分率,分别达到8.3%、99%和14.2%。双支架蛋白纤维小体利用PASC产生的乙醇产量为0.5 g/L。本论文通过分泌途径各个环节的改造和优化,包括蛋白折叠、新生肽链易位、蛋白糖基化、膜胞运输等环节的改造,提高纤维素酶等蛋白的分泌,发现蛋白糖基化的改造对于不同的蛋白具有普适性,而蛋白折叠、新生肽链易位、膜胞运输环节的改造具有蛋白特异性,发现了不同蛋白分泌的限制节点的差异,发掘了异源蛋白分泌的适配元件。在此基础上,构建了基于二硫键自组装的酿酒酵母新型纤维小体,克服了传统纤维小体展示效率低的问题。而本论文分泌途径的研究,也为进一步提高纤维小体关键组分的分泌和展示提供了坚实的理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS261.11;Q78

【参考文献】