细胞代谢物的实时质谱分析方法研究

发布时间：2018-10-04 20:43

【摘要】：在单细胞层次研究基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢物组学等已成为人们发现生命化学物质基础和深入了解其分子机制的主要方向。这主要可能是因为单细胞层次上的分析更有利于人们对生物体内微环境的认识,与常规的细胞分析方法相比,单细胞层次上的分析方法更注重细胞个体间的异质性,可以检测到在常规分析方法中由于平均结果而被掩盖掉的重要生物信息,而这些信息可能在疾病尤其是癌症的早期诊断和预防方面有着非常重要的作用。同时对生物组成的最小单位和功能相对独立的单细胞内物质成分进行分析将有助于在细胞水平上阐明生物体尤其人体代谢和遗传等方面的生理过程。但是由于细胞内物质的含量极低且种类具有复杂和多样性,所以对分析方法所需样品量、灵敏度及抗干扰能力等方面有较高的要求。目前仍没有能够同时完全满足上述条件的质谱分析方法。为了能够对单细胞实现准确、原位及直接实时的分析,本论文做了以下一些探索研究：1、细胞是一个极为复杂的体系,在使用质谱分析中会存在严重的基质效应,而且细胞内物质含量均较低,检测中如果存在较强的基质效应,会大大降低分析结果的准确性和可靠性。为了能够较好的降低或控制质谱在检测细胞样品时存在的基质效应,本文研究离子源产生基质效应的本质原因及消除方法,开发了能够克服或降低基质效应的基于超声波能的离子源。该离子源主要是利用超声波能量将分析物进行离子化,并且采用多孔材料限制喷雾的初始液滴尺寸,大大降低了液滴的尺寸并且提高了液滴尺寸的均一性,使得该离子源能够显著的克服或降低分析复杂基质时所存在的基质效应,成功的应用于血清、尿液及细胞培养液等复杂体系的研究。另外细胞代谢活动中会产生易挥发代谢产物,对其产生的气体代谢物进行检测能够很好的反映该细胞所处的生理状态。但是细胞的生存环境多为水-电解质溶液,临近环境的气体湿度较大,高湿度环境对常规质谱检测通常是一个巨大的挑战。本文开发了一种基于质子转移反应的大气压敞开式离子源,实现了对对不同生长期植物释放的气相物质的直接实时监测。2、细胞是维持生物体活动的最小单元,为了更好地保证生命活动,每个细胞中都含有很多不同类型的化合物,所以要求分析方法要能够同时实现对多种类型物质的同时检测。为了能够实现对细胞内物质全面的分析,本文建立了可以同时分析极性和非极性物质的方法。本方法采用将能够产生等离子体的大气压化学离子源与喷雾型离子化的多孔材料辅助的超声波喷雾离子源进行联合,得到了一种等离子体增强型多孔材料辅助的超声波喷雾离子源。该离子源能够同时产生等离子体型和喷雾型两种离子化模式,实现了对极性和非极性物质的同时检测,同时保留了多孔材料辅助的超声波喷雾离子源抗基质干扰的特性。3、细胞时时刻刻都在不停的运转,细胞内的物质成分和含量也在不断发生变化,这就要求分析方法能够做到对细胞内物质的实时动态监测。为了能够较好的实现对细胞内物质的实时监测,本文选用了变化较快的化学反应作为模型,使用等离子体增强多孔材料辅助的超声波喷雾离子源质谱实现了对化学反应过程的在线监测。利用等离子体增强多孔材料辅助的超声波喷雾离子源实现了氮参杂石墨烯催化的对硝基苯酚和硼氢化钠氧化还原反应的在线监测。监测到了在反应过程中反应物、中间体以及产物随时间的变化,并通过氘代实验证明该反应中还原过程的氢来自于水中的氢正离子,推测出了该反应的反应路径,成功的验证了该方法可以用于物质组成和浓度均发生变化的复杂体系的原位实时监测的能力。4、为了能够准确的知道取样的细胞位置,并且能够同时满足以上三个条件,搭建了基于感应纳升电喷雾离子化质谱与膜片钳取样技术结合的工作平台,实现了直接对哺乳动物单个细胞内液中化学物质的分析。首先使用带有微操装置的生物显微镜平台将单个细胞内液抽入纳升电喷雾离子源的喷针中,其次将该喷针放到感应纳升电喷雾离子源装置中,然后采用200 Hz,4kV的感应电压将分析物进行离子化。成功的利用质谱分析技术检测出了人胚肾细胞和脑片单个神经元中一些重要代谢产物。本文还采用四氯化碳构建了人胚肾细胞的受损模型,成功的在单细胞层次检测到不同受损程度的细胞内液中代谢物的变化,且发现其中肌酸酐的变化趋势与临床诊断结果相符。另外本文通过膜片钳与感应纳升电喷雾质谱联用方式,研究了不同年龄和不同脑区神经元中经典神经递质含量、相互关系及代谢,而且该方法能够同时获得单个神经元的生理和化学物质信息。证明了该方法可用于单细胞内物质的分析、疾病在单细胞层次上的诊断以及人体正常生理学和病理学在单细胞层次上的研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q2-33;O657.63

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本文编号：2251816