miR827-NLA-NRT1.7通路调控拟南芥硝态氮由源到库的机制研究

发布时间：2019-04-28 10:11

【摘要】：氮的再分配是植物提高氮利用效率的关键步骤之一。不同器官之间的氮转运主要由硝态氮转运蛋白(Nitrate Transporter,NRT)负责完成,但是目前对于NRT蛋白的调控机制知之甚少。拟南芥E3泛素化连接酶NLA(Nitrate Limitation Adapation)RING功能域缺失突变株nla无法适应3 mM硝酸钾低氮胁迫。有结果表明,nla缺氮适应性反应缺失是由于低氮胁迫下磷中毒造成的,而对于NLA与氮的作用关系以及NLA在植物适应低氮胁迫中的作用机制并无阐述。因此本研究通过水培、氮含量测定、氮同位素示踪等实验方法找到突变株nla与野生型表型差异的原因,并通过生理生化、分子生物学等相关手段找到NLA可能作用的靶蛋白并进行验证,阐述NLA在植物适应低氮胁迫中的作用机制。主要实验结果和结论如下:1正常氮供应条件下,野生型与突变株nla之间生长状况并无显著差异,但在低氮处理3天后,95%nla突变株老叶失绿、枯黄,而只有10%野生型出现了与突变株nla相似的表型。2与正常氮供应相比,缺氮3天后野生型与突变株nla体内的氮含量都明显下降。野生型1-4位老叶和其余叶片中的氮含量分别下降了15.5%和24.3%,而突变株nla老叶中氮含量的下降明显高于野生型,新叶中氮含量下降值则小于野生型。该实验暗示NLA可能参与拟南芥体内氮由老叶向新叶的再分配过程。3为了进一步证实2中的结论,我们对野生型及突变株nla进行了15N同位素示踪和吸收实验。将15N涂抹老叶24 h后测定发现,nla新叶中15N含量达到了11%,约是野生型新叶中15N含量的两倍。15N吸收实验则发现,nla突变株新叶中15N/老叶中15N达到了7.57,而野生型仅为4.08。4 NRT1.7主要负责老叶中硝态氮向新叶中的再分配。利用Ubpred在线软件分析表明,NRT1.7蛋白含有多个泛素化位点,其中21位、34位、606位处的赖氨酸得分最高,前两个位点集中在NRT1.7蛋白的N-端,606位赖氨酸则位于NRT1.7跨膜结构域的loop区。5共转pPR3-NLASPX及pBT3-NRT1.7质粒的酵母菌NMY51能够在SD-His-Ade-Trp-Leu培养基上正常生长,并且在加入His和X-gal后能激活β-半乳糖苷酶活性进而分解X-gal,显现蓝斑;将携带nYFP-NLA和cYFP-NRT1.7两种质粒的农杆菌共注射烟草,在细胞质膜上观察到了黄色YFP荧光信号;GST-NLA融合蛋白的Pull-down实验中则检测到了Myc-NRT1.7蛋白;Co-IP实验洗脱液中检测到了与Myc-NRT1.7相互作用的NLA蛋白。酵母双杂、BiFC、Co-IP、Pull-down等均实验证实了NLA和NRT1.7之间存在相互作用。6 Western blot实验结果发现,与过表达植株35S::Myc-NRT1.7相比,35S::NLA/35S::Myc-NRT1.7双杂植株中NRT1.7蛋白丰度显著降低。与野生型相比,突变株nla中NRT1.7蛋白表达丰度显著升高。NLA与NRT1.7的体外泛素化实验则证实完整的NLA能够降解NRT1.7。7 Northern blot、荧光定量分析及Western blot结果显示,对野生型进行低氮处理后,miR827的表达量增加,其靶基因NLA转录本无显著下调,但蛋白表达丰度随缺氮时间的延长而显著下降;对野生型,miR827加工路径突变株rdr2、dcl3以及mir827敲除突变株进行低氮处理,荧光定量分析发现NLA转录本均无明显变化;与野生型低氮处理不同,这些突变株中NLA蛋白丰度不随缺氮时间的延长而下调。上述实验表明NLA翻译水平的抑制依赖于miR827。8 mir827敲除突变株、miR827加工路径突变株rdr2、dcl3的NLA转录本无明显变化,蛋白却有明显积累;35S::MIR827纯合系中NLA的转录水平无明显下调,蛋白表达量下降。这些实验均表明miR827对NLA的调控发生在翻译水平。因此,我们的结果发现miRNA对于靶基因在翻译水平的调控与泛素化在蛋白后修饰调控共同参与植物适应缺氮胁迫的反应机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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本文编号：2467546