人信号识别颗粒SRP72的结构与功能研究

发布时间：2019-05-14 17:12

【摘要】：大多数膜蛋白和分泌蛋白会经过靶向定位或者插入内质网的蛋白共翻译易位过程,而这一过程受信号识别颗粒(Signal recognition particle,SRP)的严格调控。哺乳动物SRP复合物由Alu结构域和S结构域组成。Alu结构域由RNA末端结构和SRP9/14蛋白亚基组成;S结构域是由RNA中间结构域、SRP19、SRP54以及SRP68/72蛋白亚基组成。其中,SRP68和SRP72蛋白在不同物种之间序列高度保守,在体内以异源二聚体SRP68/72形式存在并与SRP RNA结合,对SRP正常行使其生物学功能起着至关重要的作用。经实验证实,在真核细胞中SRP68/72异源二聚体主要是在蛋白质易位过程中发挥关键作用。缺失SRP68/72的SRP蛋白会丧失其识别信号肽以及使蛋白定位于内质网的功能。目前为止,虽然已有文献报道过SRP-RNC(核糖体-新生肽链复合物)复合物的低分辨率冷冻电镜结构,但是其中不包括SRP68和SRP72蛋白,故SRP68和SRP72的结构和生物学功能尚不清楚。本论文通过原核表达并纯化获得了人源apo-SRP72蛋白和SRP68/72蛋白复合物,采用坐滴蒸气扩散法成功获得了 SRP68509-614-SRP721-163蛋白复合物晶体和apo-SRP721-163蛋白晶体,并分别使用单波长异常散射法和分子置换法解析了三维空间结构。SRP72蛋白N端结构由9个反平行α螺旋(分别命名为α1-α9)折叠形成,其凹陷的弧面紧紧地包围住一条SRP68多肽链,形成一个稳定的异源二聚体结构。此9个螺旋分别形成了四个非典型TPR模体和一个C端"帽子"结构。在不结合SRP68时,apo-SRP72蛋白在溶液中主要以"尾对尾二聚体"形式存在,同时也有一部分以单体和四聚体的形式存在。与apo-SRP72同源二聚体相比,SRP68-SRP72复合物在结合面积、结合力和稳定性等方面均存在巨大优势。由于apo-SRP72同源二聚体中的一个亚基与SRP68/72复合物中的SRP68蛋白分子之间存在强烈的空间排斥,为了形成复合物apo-SRP72同源二聚体不得不解离成两个蛋白分子。从apo-SRP72同源二聚体的解离到结合SRP68的过程中,其C端就会从摇摆不定的loop结构逐渐重构成稳定的超螺旋结构(α9),以此充当"帽子"的功能来"盖"住SRP68分子,使SRP68和SRP72蛋白顺利结合并形成稳定的异源二聚体。分析蛋白复合物的三维结构并结合体外生化实验,发现SRP68蛋白C端23个氨基酸残基组成的短肽片段(588-610)与SRP72N端(1-163)之间可通过形成疏水槽发生强相互作用。结构中所解析出来的SRP68短肽链是研究至今具有SRP72识别功能的最短片段。通过进一步结构分析、体内外生化功能研究以及定点突变实验,发现癌症病人中SRP68和SRP72突变蛋白会明显减弱SRP68/72复合物的形成,使SRP68和SRP72无法参与形成SRP大复合物,进而影响SRP与内质网的结合,最终使得SRP复合物丧失对蛋白质的内质网定位功能。本论文通过解析人源apo-SRP72和SRP68/72的三维结构,为深入研究SRP的蛋白转运功能提供结构依据。在分析结构的基础上,提出了 SRP68和SRP72基于结构改变引起的疾病模型,为抗疾病肽类药物分子的设计提供重要的结构信息。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q51

【参考文献】