利用特定转录因子的mRNAs诱导小鼠体细胞重编成为多能状态的研究

发布时间：2017-03-19 23:04

  本文关键词：利用特定转录因子的mRNAs诱导小鼠体细胞重编成为多能状态的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞分化是一个由少数特化细胞变为一个完全分化的细胞类型的发育生物学过程。在多细胞生物的发育过程中,细胞分化使得生物由一个简单的合子变为具有复杂细胞类型和组织的系统。细胞分化过程是一个庞大的基因调控网络,包括一些进化保守的分子过程,比如细胞信号转导,参与调控分化相关基因的开关。尽管目前已有众多关于细胞分化的调节机制的研究,但对于发育过程中细胞分化和特异化的机制尚不明确。为了解决之一问题,将已分化的细胞逆转为多能性细胞,进而探讨细胞的分化机制就显得尤为必要。长时间以来,大部分学者认为细胞在分化过程中会失去不再需要的染色体或永久可灭活的基因,因此这些分化的体细胞命运无法重新编程。但是,细胞融合、体细胞核移植等实验方法以及提取的所有细胞表明细胞的命运可以被逆转并具有胚胎时期的特性,这暗示可溶性的反式作用因子在细胞中的存在,且可以赋予细胞从一个状态转变到另一个状态的能力,通过发现和识别,这些因子被认定主导细胞特化和分化作用。这就表明在细胞分化过程中起重要作用的是可逆的表观遗传变化,而非不可逆的基因变化。对基因重编程的不同理解为进一步探索在发育过程中细胞分化机制提供了新的方法和途径。目前利用体细胞重编程产生多能性细胞已取得很大成就,为进一步了解分化和去分化机制提供帮助,并在科学和医学上领域能够取代ES细胞以克服非伦理限制。此外,细胞重编程获得的多能性细胞在医疗过程避免了免疫排斥的风险,因为它来自于患者自身的细胞。而且,它能够参与到组织工程、再生医学细胞替代疗法和药物开发。目前通过体细胞核移入卵母细胞(SCNT)以及体细胞和多能性细胞进行细胞融合的方法能够使细胞进行重编程而具有多能性。最近通过病毒介导特定转录因子(TFs)异位表达也具有同样的功效。自此,由于病毒介导转基因在操作过程中的危险,以及转基因介导的方法因DNA序列集成的限制可导致原癌基因表达导致恶性肿瘤和不良后果,所以该方法一直在不断的改进。尽管把以非整合DNA为基础的方法如：腺病毒,仙台病毒或空病毒法作为质粒、小环状和非整合型附着载体的使用,DNA的集成问题还是难以避免。故而,通过DNA转染的方式让相关蛋白质和转录因子在细胞中表达使得体外多能性的诱导成为可能。但是,这一方法仍然面临众多问题：成本高,效率低以及无法完全了解转入细胞中蛋白质的具体功能。而且,在非整合重编程获得多能性细胞的过程中发现过表达和microRNAs转染与多能性有关联,但是具体机制尚不明确。最近,科学家使用一种更加安全的重编程方法：通过导入编码重编程因子的mRNA分子进入体细胞(mRNA介导的基因传递)。这种方法在造血干细胞、充质基质细胞、树突状细胞、淋巴细胞和来源于神经元中的星形胶质细胞中使用能够高效的促进蛋白表达；并且成纤维细胞和星形胶质细胞被重编程为心肌细胞。目前这项技术已经证实,在人类体细胞成编程产生多能性性细胞,在转染的体细胞多能性基因被成功激活。依赖相关因子易位表达的重编程与主要的基因,表观遗传修饰相结合能够克服重编程过程中的转录障碍。鉴于利用重编程因子mRNA来诱导小鼠的多能性的相关报道较少,我们在使用mRNA转染方法的基础上,旨在将小鼠成纤维细胞去分化或重编程,逆向回到其多能性特性细胞的发育阶段。为了实现这一目标成果,首先我们克隆与多能性相关的基因或因子的全序列,插入T7启动子下游,构建真核表达载体。其次,包含因子的新型重组载体用于体外合成mRNA,转染至受体成纤维细胞中,目的是重编程具有胚胎干细胞特性,通过特异的形态学、分子和功能分析检测这些重编程获得的细胞的特性。最后,探索重编程机制,通过在重编程过程中跟踪其表达和启动子甲基化变化,我们检测了一些多能性标记的遗传和表观遗传变化以及表观遗传分子的影响。本研究为更好的理解重编程过程调节提供基础,并且有助于发现早期胚胎发育机制。本研究结果包括以下几点：1.根据Gnen Bank公布的四个多能性转录因子Oct4, Sox2, c-Myc,和Klf4 (OSCK)的序列并克隆。从鼠的睾丸、小肠和结肠等组织中反转录(RTPCR)获得OSCK的开放阅读框或编码区(CDS)。结果显示,OSCK的CDS长度分别为1059 bp,960 bp,1320 bp和1452 bp。NCBI BLAST测序结果显示,每一个基因都与属的参考序列具有高序列同源,Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4分别为100%,100%,100%和99%。这些说明克隆的四个基因序列正确。2.通过体外克隆真核表达载体下游到T7启动子的开放阅读框(ORF)来构建体外转录模板并且在体外转录反应过程中在5’端加帽子,在3’端加poly (A)尾巴。合成的mRNA通过阳离子脂质体转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,转染第二天RT-PCR检测到mRNA的高表达。间接免疫荧光染色表明该mRNA表达的蛋白在细胞核中表达。3.通过流式细胞(FACS)分选转染编码GFP的mRNA的细胞,我们优化的转染体系为每1×105 MEF最适mRNA量为lug,并且检测出持续几天均具有高表达,随后由于mRNA和蛋白的降解而降低,结果说明了需要几次重复转染mRNA来保持蛋白的长时间高水平表达,这对于细胞重编程来说是必需的。经过五次连续转染,观察到成纤维细胞的间充质表面出现细胞形态变化,呈现紧凑的上皮细胞的形状,且在转染期间不断增加直到在重编程的第8天出现类似克隆的结构,随着时间变化,在第15天,克隆数量达到100-130个,尺寸上逐渐增大,呈现明显的边缘,具有高的核质比。新生的类ES克隆呈现AKP阳性,通过RT-PCR或免疫染色技术显示表达ES细胞特异性标记基因。新转变的细胞同样也显示出与ESC相近的启动子甲基化模式以及体内和体外分化为三个主要发育的胚层的能力,免疫染色显示胚层特异性标记物显示阳性；βⅢ微管蛋白(外胚层),平滑肌肌动蛋白(SMA)(中胚层)以及Sox17(内胚层)。在体内,畸胎瘤形成包含所有三个胚层的组织,包括软骨、肌肉、脂肪(中胚层),色素上皮组织(外胚层)以及上皮组织(内胚层)。因此,当转染鼠特异合成mRNA,鼠多能性基因的激活和诱导的多能性干细胞的产生可以通过一个安全的方式获得。4.在此期间,通过检测的一些多能性标志物的表达水平与启动子甲基化状态,本研究检测了在重编程期过程中相关基因的表达变化。上皮基因如E-钙粘蛋白(CDH1)持续上调伴随,间叶细胞基因如Snail和Thyl持续下调,并伴随间质细胞向上皮细胞的过渡过程中的形态变化。转染和非转染多能性基因的表达：在转染期间(第一个6天)表现转录因子(OSCK)显著上调,转染停止后这些因子有一段时间的下调。我们的研究揭示了当大部分转录因子降解过程中,在第12天开始产生了第二次的基因上调,原因可能是由于这些因子的内源性基因被激活。一旦在实验中转染,我们检测到重编程过程中多能性相关的因子(Oct4, Nanog, REX1和N-Myc1)的启动子区域的甲基化水平逐渐减少,结果表明它们是激活的非活性的多能性基因。这可能是由于启动子区／或增强子区域逐步去甲基化,从而激活这些因子。5.在这项研究中,我们证明,在小鼠胚胎成纤维细胞进入重编程过程中使用维生素C和组织蛋白去乙酰化抑制剂能够促进的多能性相关基因的高效表达。
【关键词】：重编程 多能性 甲基化 诱导多能干细胞 小分子 克隆 体外转录
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• Abstract3-7
• 摘要7-16
• List of abbreviations16-18
• Chapter 1. Review of literature18-83
• 1. Embryo development18-19
• 2. Stem Cell Sources and Pluripotency19-21
• 2.1 Embryonic Stem Cells19-20
• 2.2 Adult Stem Cells20-21
• 2.3 Induced Pluripotent Stem Cells21
• 2.4 Trans-differentiation21
• 3. Pluirpotency mechanism and its controlling network21-25
• 4. Importance and limitations of Pluripotent Cells25-26
• 5. Cellular Reprogramming26-35
• 5.1 Methods of Reprogramming27-35
• 5.1.1 Somatic Cell Nuclear Transfer(SCNT)28-30
• 5.1.2 Cell Fusion30-32
• 5.1.3 Whole Cell Extracts32-33
• 5.1.4 Controlling the expression of the master transcription factors33-35
• 6. Induced pluripotency35-49
• 6.1 Variable parameters of the induced pluripotency37-48
• 6.1.1 Choice of Reprogramming Factors37-38
• 6.1.2 Choice of Cell Type38-39
• 6.1.3 Factors delivery into target cells39-45
• 6.1.3.1 Viral transduction of the transgenes of defined transcription Factors39-41
• 6.1.3.2 Non-Viral introduction of transgenes encoding the reprogramming factors41-42
• 6.1.3.3 Transgene-Free Reprogramming42-45
• 6.1.3.3.1. Protein-Based Reprogramming42-44
• 6.1.3.3.2. Reprogramming Mediated by mRNA Encoding Defined Factors44-45
• 6.1.3.3.3. Pluripotency induction by microRNAs45
• 6.1.4 Culture and derivation conditions45-48
• 6.1.4.1 Culture conditions during reprogramming45-46
• 6.1.4.2 Small Molecules46-48
• 6.2 Identification and characterization of the reprogrammed pluripotent Cells48-49
• 7. Molecular mechanism of induced pluripotency49-53
• 8. Epigenetics and reprogramming53-62
• 8.1 Epigenetic code53-54
• 8.2 Epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency54-62
• 8.2.1 Global chromatin reorganization in pluripotency reprogramming57
• 8.2.2 Roles of DNA modifications in ESC maintenance and reprogramming to pluripotency57-61
• 8.2.3 Histone modification and remodeling during iPS reprogramming61-62
• 9. New scientific streams have emerged from reprogramming technology62-67
• 9.1 Cell Replacement for Regenerative Medicine63-64
• 9.2 Tissue Engineering64
• 9.3 Disease modeling and disease physiopathology64-65
• 9.4 Drug Discovery and Toxicity Assessment65-66
• 9.5 Limitations and Perspective66-67
• References67-83
• Chapter 2. Molecular cloning of the pluripotency genes.83-100
• 1. Introduction83-85
• 2. Material and methods85-94
• 2.1 RNA extraction85-87
• 2.2 cDNA synthesis87
• 2.3 cDNA quality assessment87-88
• 2.4 Primer design and PCR amplification88-90
• 2.5 Gel purification of PCR Products90
• 2.6 Ligation of Genes into cloning vector90-91
• 2.7 Preparation of the competent cells for transformation91
• 2.8 Transformation of Ligated DNA into Bacterial Cells91-92
• 2.9 Colonies pick up,screening for positive colonies and plasmid extraction92-93
• 2.10 Screening for Positive Colonies93
• 2.11 DNA Sequencing to Confirm Correct DNA Identity93-94
• 3. Results94-97
• 3.1 PCR amplification of the interested factors94-95
• 3.2 Cloning of factors into the simple T vector95-96
• 3.3 Confirmation of the successful cloning of the desired genes96-97
• 4. Discussion97-98
• References98-100
• Chapter 3. In vitro transcription and assessment of muline pluripotency transcrlption factors'mRNAs100-114
• 1. Introduction100-102
• 2. Mate rials and methods102-105
• 2.1 Restriction Enzyme Digestion & Purification of the interested products102
• 2.2 Ligation of Gene into Expression Vector102
• 2.3 Bacterial transformation,colonies pick up and screening of the positive colonies102-103
• 2.4 In vitro transcription of mRNAs of the four transcription factors(Oct4,Sox2,c-Myc and Klf4)103-104
• 2.4.1 Linearization of the recombinant plasmids103-104
• 2.4.2 Capped transcription reaction assembly104
• 2.4.3 Poly(A)tailing procedure104
• 2.5 Recovery of the synthesized RNA104-105
• 2.6 In vitro assessment of the synthesized mRNAs105
• 3 Results105-110
• 3.1 Construction of the expression plasmids containing the transcription factors105-107
• 3.2 In vitro transcription of the desired factors107-108
• 3.3 Evaluation of the synthesized mRNAs108-110
• 4. Discussion110-111
• References111-114
• Chapter 4. Reprogramming of mouse embryonic fibroblast cells by mRNAs transfection114-140
• 1. Introduction114-116
• 2. Materials and methods116-124
• 2.1 Mouse Embryonic fibroblast(MEF)Isolation116
• 2.2 Cell Culture116-117
• 2.3 Cell Harvesting117-118
• 2.4 Cell freezing118
• 2.5 Cell Thawing and Recovery118-119
• 2.6 Cell transfection119
• 2.7 Flourescence Activated Cell Sorting(FACS)119
• 2.8 Alkaline phosphatase staining119-120
• 2.9 Immuno-fluorescence120
• 2.10 Quantitative real-Time PCR(qPCR)120-121
• 2.11 Bisulfite Genomic Sequencing121-122
• 2.12 In Vitro Differentiation of mRNA iPSCs122
• 2.13 Teratoma Formation and Histological Analysis122-123
• 2.14 Apoptosis and dead cell detection123-124
• 2.15 Karyotyping of the cells124
• 3. Results124-135
• 3.1 Isolation of mouse embryonic fibroblast cells124-125
• 3.2 Optimization of the transfection conditions125-126
• 3.3 Kinetics and stability monitoring of the intracellular expressed proteins126-127
• 3.4 Subcellular localization of the transfected factors127-130
• 3.5 Morphological changes during reprogramming process130
• 3.6 Morphological characterization of the generated colonies130-131
• 3.7 Immunofluorescence identification of the generated colonies131-132
• 3.8 Molecular characterization of the generated pluripotent like cells132-133
• 3.9 The developmental potential of the derived pluripotent like cells133-135
• 4. Discussion135-136
• References136-140
• Chapter 5. Genetic and epigenetic changes during reprogramming by mRNAs140-163
• 1. Introduction140-141
• 2. Materials and methods141-145
• 2.1 Cell culture141
• 2.2 Cell transfection141-142
• 2.3 Immuno-fluorescence142
• 2.4 Quantitative real-Time PCR(qPCR)142
• 2.5 Genomic DNA extraction142
• 2.6 Bisulfite conversion(C-T conversion) of DNA142-143
• 2.7 PCR amplification of the desired product(promoter region)143-144
• 2.8 Gel purification of PCR products and its cloning144
• 2.9 Methylation status analysis144-145
• 3. Results145-157
• 3.1 Expression level changes in the introduced factors and pluripotency markers during reprogramming145
• 3.2 Mesenchymal-to-epithelial transition(MET)during reprogramming145-148
• 3.3 Changes in methylation status of pluripotency factors' promoters during reprogramming148-157
• 4. Discussion157-160
• References160-163
• Chapter 6. Effect of some small molecules on the genetic changes duringreprogramming163-175
• 1. Introduction163-165
• 2. Materials and methods165
• 2.1 Cell culture165
• 2.2 Cell transfection165
• 2.3 Quantitative real-Time PCR(qPCR)165
• 2.4 Alkaline phosphatase staining165
• 3. Results165-170
• 4. Discussion170-172
• References172-175
• Conclusion175-176
• Acknowledgements176-177
• Publications177-178

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